一種解澱粉芽孢桿菌和微生物菌劑及其應用的製作方法

2023-06-22 12:57:11 3

一種解澱粉芽孢桿菌和微生物菌劑及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於防治花生葉斑病的拮抗菌及其微生物製劑，屬於農作物病害生物防治領域。本發明提供了一株保藏號為CGMCCNo.8341的解澱粉芽孢桿菌BA-KA1(Bacillusamyloliquefaciens)，以及含有此解澱粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還提供了所述解澱粉芽孢桿菌或微生物菌劑在防治花生葉斑病中的應用。本發明提供的保藏號為CGMCCNo.8341的解澱粉芽孢桿菌BA-KA1及其微生物菌劑對花生葉斑病菌有顯著拮抗作用，能夠防治花生葉斑病的發生，防治效率在70%以上。該菌株及其微生物製劑的使用，可以降低花生生產過程中化學農藥的施用，具有良好的生態和社會效益。
【專利說明】一種解澱粉芽孢桿菌和微生物菌劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種對花生葉斑病有拮抗作用的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl菌株和能夠防治花生葉斑病的微生物菌劑，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】 [0002]花生葉斑病是葉部黑斑病、褐斑病的總稱,該病主要發生在葉片上，葉柄、託葉,莖也受其害，一般情況下先在下部葉片上開始發病，逐步向上部葉片蔓延，發病嚴重時在莖杆、葉柄、果針等部位均能形成病斑，葉片正面的葉斑周圍有清晰地黃色暈輪，葉片黃褐色至暗褐色。
[0003]目前，農民對花生葉斑病的認識不足，認為花生生育後期的葉斑病基本不影響產量，所以很少防治。然而，花生葉斑病的發生會引起植株葉片壞死或落葉，從而導致花生生育後期光合作用不足，嚴重影響了花生的產量，發病嚴重時產量損失達30%以上，因此急需進行有效防治。一些化學殺菌劑如甲基託布津、多菌靈等具有一定的防治花生葉斑病的效果，但是這些農藥長期使用，一方面會引起病原菌抗性，另一方面化學藥劑的使用還會造成環境汙染。
[0004]利用拮抗微生物防治農作物病害由於具有低汙染、低殘留、不引起病害抗性等優點，該防治方式的關鍵是進行對病原微生物有拮抗作用、且抑菌譜廣的拮抗微生物的篩選和製備製劑。目前在花生葉斑病生物防治方面的研究還很少，本發明的目的在於篩選出一種能夠高效拮抗花生葉斑病病原菌的微生物菌株，並形成微生物菌劑，通過生物防治的方式降低花生葉斑病給花生生產帶來的危害。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於克服目前利用化學農藥防治花生葉斑病帶來的環境危害，提供一種能夠高效拮抗花生葉斑病的解澱粉芽孢桿菌菌株及微生物製劑，該製劑噴施於花生葉片上，可以有效防治花生葉斑病，從而減少花生生產中化學農藥的使用，降低環境汙染，提
高花生的產量。
[0006]本發明的技術方案如下:
本發明的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl於2013年10月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCCN0.8341。
[0007]本發明所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl拮抗花生葉斑病病菌。
[0008]本發明所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl對群結腐黴、小麥赤黴病菌、灰黴病菌、絲核菌、菸草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫黴病菌、棉花枯萎病或番茄早疫病菌具有拮抗作用。
[0009]本發明的微生物菌劑含有解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KA1，其中所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl於2013年10月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCCN0.8341。[0010]本發明的微生物菌劑在防治花生葉斑病中的應用。
[0011]本發明所述微生物菌劑中的總活菌數不低於5X IO9個/g。
[0012]本發明微生物菌劑的製備方法包括以下步驟:
步驟一:按體積比5.0%的比例將培養好的種子液接種到大量發酵培養基中，28°C，培養36h，得到發酵液；
步驟二:將步驟一的發酵液與基質等量混合均勻並乾燥，得到微生物菌劑。
[0013]本發明的微生物菌劑的製備方法步驟一中所述的大量發酵培養基包含葡萄糖
2.5% (m/V)、蛋白腖0.8% (m/V)、酵母膏0.58% (m/V)、磷酸二氫鉀0.35% (m/V)和碳酸鈣
0.25% (m/V), pH 值 7.2。
[0014]本發明的微生物菌劑的製備方法步驟一所述種子液通過下述方法獲得:將保存的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl劃線轉接到PB平板中，置於培養箱28°C恆溫培養2天；將獲得的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl的菌苔接種到PB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養18h得到種子液。
[0015]本發明的微生物菌劑的製備方法步驟二中所述的基質選自微粉碳酸鈣和/或沸
O
[0016]本發明通過大量篩選工作，篩選到了一株對花生葉斑病病菌有較強拮抗作用的拮抗菌BA-KA1，通過生理`生化方法和16SrDNA方法將該菌株鑑定為解澱粉芽孢桿菌{Bacillus amyloliquefaciens\該菌株已於2013年10月15日進行保藏,保藏編號為CGMCC N0.8341 ;保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，郵編100101。
[0017]用上述能夠拮抗花生葉斑病菌的BA-KAl菌株所生產的微生物製劑中含有5X IO9個/g以上的解澱粉芽孢桿菌BA-KA1、相應培養基和助劑。其生產方法包括:
(1)將保存的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl劃線轉接到PB平板中，置於培養箱28°C恆溫培養2天；
(2)將步驟(1)培養好的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl的菌苔用接種環刮取接種到PB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養18h得到種子液；
(3)將步驟(2)培養好的種子液按5.0%的比例(體積比)將種子液接種到大量發酵培養基中，配方為葡萄糖2.5%、蛋白腖0.8%、酵母膏0.58%、磷酸二氫鉀0.35%、碳酸鈣0.25%，pH值7.2，培養溫度28°C，培養時間36h，發酵完成後得到發酵液；
(4)將步驟(3)將發酵液與基質(選自微粉碳酸鈣、沸石中的一種或多種)等量混合均勻並乾燥，得到微生物菌劑。
[0018]上述微生物菌劑可用於防治花生葉斑病。
[0019]3.有益效果
本發明涉及能防治花生葉斑病的拮抗微生物菌株及其微生物菌劑，該產品具有如下優
佔-
^ \\\.I)具有良好的防病作用:該菌劑中含有能夠高效拮抗花生葉斑病菌生長的解澱粉芽孢桿菌BA-KA1，菌劑中該菌株的達到5X109f/g以上，該菌株噴灑於花生葉片上能夠有效抑制花生葉斑病的發生。
[0020]2)具有良好的促生作用:該菌劑施用後能夠有效抑制花生葉斑病的發生，增加花生的光合面積，從而促進花生營養生產和生殖生長，提高花生產量。
[0021 ] 3 )無毒無汙染無殘留:該微生物菌劑是由解澱粉芽孢桿菌、部分培養基和基質(選自微粉碳酸鈣、沸石中的一種或多種)組成，無任何有毒有害成份，在花生生產中使用具有無毒、無汙染、無殘留的優點，符合我國生產綠色食品的要求。
[0022]生物樣品保藏信息
解澱粉芽抱桿菌BA-KA1,分類命名為Bacillus amyloliquefaciens,已於2013年10月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCCN0.8341。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1顯示了花生葉斑病的發病症狀。
[0024]圖2顯示了花生葉斑病的病原菌菌落形態。
[0025]圖3顯示了本發明篩選的保藏號為CGMCC N0.8341的解澱粉芽孢桿菌菌株在固體PB培養基上培養48小時的菌落形態。
[0026]圖4顯示了本發 明篩選的保藏號為CGMCC N0.8341的解澱粉芽孢桿菌的菌體形態照片。
【具體實施方式】
[0027]本發明提供了一種解澱粉芽孢桿菌BA-KA1，其中該解澱粉芽孢桿菌的保藏號為CGMCC N0.8341。
[0028]本發明還提供了一種能夠防治花生葉斑病的微生物製劑，其中該製劑以解澱粉芽孢桿菌作為活性成分，以PB培養基和基質(選自微粉碳酸鈣、沸石中的一種或多種)為載體，其中，該解澱粉芽孢桿菌的保藏號為CGMCC N0.8341，該製劑中解澱粉芽孢桿菌BA-KAl的活菌數達到5 X IO9個/g。
[0029]以下結合優選實施例對本發明的技術方案進行詳細地闡述。以下實施例僅僅用於說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。
[0030]實施例1對花生葉斑病菌具有拮抗作用的細菌的分離、篩選
採集不同生態環境的土壤樣品並於實驗室中進行細菌分離，在PB培養基上進行多次分離純化，得到純培養菌落後，以花生葉斑病球座尾孢菌為指示菌(如圖2所示)，採用對峙試驗方法進行拮抗性能高的菌株的篩選。
[0031]具體步驟:上述土壤樣品經梯度稀釋後塗布於PB培養基中，於28°C恆溫培養箱培養。上述培養基根據「微生物培養基手冊」的記載製備得到，培養基配方為:牛肉膏5g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，自來水1000ml, pH7.2~7.4，121°C滅菌20min後使用。待平板長出菌落後，挑取不同形態的單菌落採用劃線分離法反覆進行分離純化，直到得到單菌落的純培養物，純化後的菌株保存於PB培養基斜面。
[0032]以花生葉斑病球座尾孢菌為指示菌，採用十字交叉法測定不同菌株對花生葉斑病球座尾孢菌生長的抑制率。將篩選出的細菌菌株點接在距平板中央3cm處的4個角上，平板中央同時接種直徑5mm的活化的花生葉斑病球座尾孢菌菌塊，每個菌株重複三次，以只接種花生葉斑病菌菌塊的為對照，28°C恆溫培養5d，測量、記錄抑菌圈直徑的大小並計算平均抑制率。篩選出了對花生葉斑病菌拮抗作用最強的菌株，該菌株的編號為BA-KA1，並對該菌株進行了保藏，保藏號為CGMCC N0.8341。
[0033]實施例2 BA-KAl的抑菌譜測定
以群結腐黴、小麥赤黴病菌、灰黴病菌、絲核菌、菸草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫黴病菌、棉花枯萎病、番茄早疫病菌等9種病原菌為靶標，測定BA-KAl的抑菌譜，BA-KAl對9種病原真菌都具有較強的拮抗作用，對所有的病原菌的拮抗作用都在40%以上，其中對番茄早疫病菌的抑制作用最強，為74.3%。
[0034]表1解澱粉芽孢桿菌BA-KAl對不同病原真菌的抑制作用
【權利要求】
1.一種解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl，該解澱粉芽孢桿菌於2013年10月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCCN0.8341。
2.根據權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl，其特徵在於其拮抗花生葉斑病病原菌。
3.根據權利要求2所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl，其特徵在於其對群結腐黴、小麥赤黴病菌、灰黴病菌、絲核菌、菸草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫黴病菌、棉花枯萎病和番茄早疫病菌具有拮抗作用。
4.一種微生物菌劑，其特徵在於其含有權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl，其中所述的解澱粉芽孢桿菌BA-KAl於2013年10月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCCN0.8341。
5.根據權利要求4所述的微生物菌劑，其特徵在於其在防治花生葉斑病中的應用。
6.根據權利要求5所述的微生物菌劑，其特徵在於所述微生物菌劑中的總活菌數不低於 5X109 個/g。
7.一種根據權利要求4所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於其包括以下步驟: 步驟一:按體積比5.0%的比例將培養好的種子液接種到大量發酵培養基中，28°C，培養36h，得到發酵液； 步驟二:將步驟一的發酵液與基質等量混合均勻並乾燥，得到微生物菌劑。
8.根據權利要求7所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟一所述種子液通過下述方法獲得:將保存的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl劃線轉接到PB平板中，置於培養箱28°C恆溫培養2天；將獲得的解澱粉芽孢桿菌菌株BA-KAl的菌苔接種到PB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養18h得到種子液。
9.根據權利要求7所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟一中所述的大量發酵培養基包含葡萄糖2.5% (1^)、蛋白腖0.8% (m/V)、酵母膏0.58% (m/V)、磷酸二氫鉀0.35% (m/V)和碳酸鈣 0.25% (m/V)，pH 值 7.2。
10.根據權利7所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟二中所述的基質選自微粉碳酸鈣和/或沸石。
【文檔編號】C12R1/07GK103695356SQ201310718332
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】黃亞麗, 馬宏, 劉昆昂, 賈振華, 宋聰, 趙芊, 黃媛媛, 宋水山, 李書生 申請人:河北省科學院生物研究所