一種原代細胞大規模繼代培養的方法

2023-06-05 11:58:16

專利名稱：一種原代細胞大規模繼代培養的方法
技術領域：
本發明涉及在生物製品領域中原代細胞大規模繼代培養的方法，具體說是一種將原代細胞通過一定的技術手段培養並篩選出保持其細胞二倍體生物學性狀的，高活力的繼代細胞(指自組織分離後體外培養不超過5代細胞)，並利用生物反應器或細胞工廠方式實現大規模培養的方法。
背景技術：
目前，國內外已有許多關於利用生物反應器，微載體及細胞工廠培養動物細胞的報導。細胞微載體培養方法是由Van Wezel於1967年構思發明的，經過40年來人類大量的摸索，該技術已經日趨成熟和完善，並廣泛應用於生物工程領域以及一些具有重要價值的細胞產品。微載體細胞培養技術具有許多傳統細胞培養技術無法取代的優勢，例如在生 物反應器中，微載體增加了單位容積中的表面積；為細胞提供了均相的生長環境；環境條件容易測量與監控；細胞培養操作可系統化、自動化，降低了汙染發生的機會。但該技術主要用於傳代細胞系的培養，但用於原代細胞培養，因無法批量獲得保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的細胞，限制了其大規模生產應用。原代細胞可用於生產狂犬疫苗、乙腦疫苗、流感疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗和流行性出血熱病毒疫苗等，這些疫苗的生產需要使用大量動物，而傳統的細胞培養技術不能完全排除外源因子汙染的可能，質量難以控制，制約了疫苗製品的規模化生產。基於上述原因，也限制了原代細胞或其繼代細胞在生物製品生產中無傳代細胞系潛在致腫瘤性風險優勢的應用。

發明內容
為解決上述技術問題，本發明的目的是一種原代細胞大規模繼代培養的方法。本發明是一種原代細胞大規模繼代培養的方法，在本發明中用來培養的原代細胞是本領域技術人員所熟悉的那些原代細胞，例如猴腎細胞、地鼠腎細胞、家兔腎細胞、雞胚細胞、沙鼠細胞、牛腎細胞等。該方法包括下列步驟a)批量獲取保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞(指自組織分離後體外培養不超過5代細胞)；b)適於利用生物反應器或細胞工廠細胞的篩選；c)利用生物反應器或細胞工廠大規模培養篩選出的細胞。在本發明中，批量獲取保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞的培養方法如下來源於動物機體組織的細胞在利用轉瓶培養的方法初代培養成功後，要保持其在反覆傳代中不發生轉化或不停止生長其措施是嚴格控制pH值(7. 2 . 4之間)；最好在5%C02 (指CO2濃度)環境中培養；並最好根據原代細胞的種類及分化程度，在轉瓶的內表面包被膠原、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白等；嚴格控制換液時間，不宜太長(最長8天或連續灌注)，換液時，不要全部更新，儘量保留一部分舊培養液，以棄掉1/2 2/3為宜；細胞生長至75、5%匯合階段即按一分為二的原則進行傳代；培養液與液面以上空間的體積比例保持在1:8 1:12之間；加入培養液的高度要控制在8mm以下。利用上述方式獲得的細胞含有細菌、真菌、支原體、外源病毒的潛在可能性較大，其生物學性狀改變或活力不夠的可能性也較大。因此，利用生物反應器或細胞工廠立即進行大規模擴增，失敗的風險性很高，導致其不能實現工業化應用，必須進行細胞的鑑別與篩選，其措施如下a)原代細胞培養物細菌、真菌、支原體、病毒等外源汙染檢測，可採取《中國藥典》收載的常規檢測 方法，更適宜採用檢測時間短的酶標等替代方法，b)用乳糖脫氫酶法測定乳糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，通過葡萄糖消耗來判定原代動物細胞的生長狀態；c)細胞損傷檢測，通過細胞損傷檢測來調整批量獲取高活力的繼代細胞的操作工藝參數，是不同種類及分化程度原代細胞利用生物反應器或細胞工廠進行大規模培養成功的重要條件之一，該項檢測在確定某一具體細胞培養工藝時，十分必要。根據用正常不能滲透的大分子示蹤劑標記細胞質的原理鑑別受傷細胞。細胞膜破裂，示蹤劑進入細胞質，然後破裂處封閉，示蹤劑位於細胞內。死細胞的細胞膜破裂後不能封閉，只要洗去全部外源性示蹤劑則不被標記。有幾種示蹤劑供選擇。螢光素標記的右旋糖酐比較適宜。如果使用醛固定的標本，須用結合有賴氨酸的右旋糖酐。外加性示蹤劑的優點是已知加入和除去示蹤劑的時間，如螢光素標記的右旋糖酐。因此可用於脈衝追蹤標記方案，以便確定細胞損傷時間的選擇。定義與鑑定細胞損傷的標準(A)機械性應力引起細胞膜破裂；(B)正常情況下不能滲透的分子可通過破裂處進出細胞；(C)損傷處迅速封閉(< 5s，受鈣離子介導的細胞膜移動和融合的調節)，細胞存活；(D)在存在損傷示蹤分子(正常情況下不能滲透)條件下發生細胞破裂時；(E)示蹤分子進入細胞內；(F)細胞膜封閉時，示蹤分子滯留於細胞。如果在顯微鏡測定或螢光方面可觀察到損傷示蹤劑，能鑑定受傷細胞。經過上述兩個步驟進行培養篩選的細胞可立即利用生物反應器或細胞工廠進行大規模擴增，也可凍存為種子細胞，用於生產時，解凍一支或數支，這樣可以實現一批凍存細胞進行長期生產使用，實現大規模工業化生產的目的。篩選出的細胞利用生物反應器或細胞工廠大規模培養的措施是選取細胞工廠或剪切力小的固定床籃式培養系統的生物反應器進行原代細胞大規模繼代培養，選取連續灌注方式，以獲得保留一部分舊培養液培養效果，其它培養參數設定也應選取較連續傳代細胞系更溫和的培養條件。本發明的效果是利用a)批量獲取保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞(指自組織分離後體外培養不超過5代細胞)；b)適於利用生物反應器或細胞工廠細胞的篩選；c)利用生物反應器或細胞工廠大規模培養篩選出的細胞三個步驟中全部或大部分操作工藝達到原代細胞大規模繼代培養的目的。本發明與現有轉瓶培養原代細胞方式比較，生物反應器綜合可比因素分析對比，用本發明的產量比現有技術中的轉瓶方法提高了 100倍以上，可以達到傳代細胞系利用生物反應器達到的產量；細胞工廠綜合可比因素分析對比，用本發明的產量比現有技術中的轉瓶方法提高了 10倍以上，不僅提高了培養原代細胞單位體積的細胞培養率，還提高了原代細胞的質量，將此技術應用於疫苗製品的生產，也會提高疫苗製品的產品質量和生產規模及生產效率。
具體實施例方式以下的實施例詳細說明了本發明，但不用於限制本發明的範圍。實施例一地鼠腎細胞篩選及利用生物反應器及以聚酯切片為載體培養
在本發明的實施方案中，所述細胞為原代地鼠腎細胞經轉瓶繼代培養一代後；採用總體積為5升的生物反應器(Cellige n Plus 生物反應器,購自New Brunswick ScientificCo.，Inc.公司)和聚酯切片載體(Fibra-Cel Disks);所用的培養基是M199培養基或DMEM培養基。所用其它試劑包括牛血清、胰酶等。I、將地鼠解剖取腎細胞，用胰蛋白酶進行消化，製得原代細胞；嚴格控制pH值為7.2 ;將蓋有透氣塞的三L轉瓶置於37°C，5%co2環境中培養，三L轉瓶內表面經O. Γ mg/ml的多聚賴氨酸包被後,用無Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；換液時間為4天，換液時,保留1/3舊培養液，細胞生長至95%匯合階段即按一分為二的原則進行傳代，培養液與液面以上空間的體積比例保持在1:10，加入培養液的高度要控制在4mm。2、採取《中國藥典》收載的常規檢測方法對原代細胞培養物細菌、真菌、支原體、病毒等外源汙染檢測；用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，通過葡萄糖消耗來判定原代動物細胞的生長狀態；細胞損傷檢測將待檢細胞放於無菌的蓋玻片上，用適量細胞培養液培養至單層，用無菌Dulbecco磷酸鹽水浸先一次；將蓋玻片細胞面朝上放於培養皿中，將5mg/mlFDxLys溶液(100 μ I)注於蓋玻片上面，然後吸去，如此反覆幾次；模擬工藝操作參數建立可引起細胞損傷的實驗條件，不要幹擾陰性對照；作為陽性對照，用單刃剃鬚刀刮蓋玻片約10次後用位相差顯微鏡觀察，以確保用此方法從底物上刮除細胞；受傷細胞後示蹤劑處理時間應儘量短，再用無菌Dulbecco磷酸鹽水浸先一次，然後加入培養液，將培養皿放入培養箱，使細胞在理想時間內儘快恢復正常狀態；用無菌Dulbecco磷酸鹽水將蓋玻片清洗3次,然後用3. 7%甲醛浸泡10 — 30min ;用注射用水將蓋玻片洗2次,然後用抗漂白封固液封片，在突光顯微鏡下觀察。3、通過上述1、2項操作，剔除不合格細胞，然後以IX l(TlX IO7個細胞/ml的密度接種於裝有聚酯切片載體的生物反應器內；接種後，使攪拌速度調節為90rpm，在37°C下培養5-8天，培養期間補加新鮮的培養基，使培養基中葡萄糖含量保持在5克/升。調節02，N2，C02氣體的流速，培養期進行檢測。乳糖濃度，用乳糖脫氫酶法測定；葡萄糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測定，通過葡萄糖消耗來判定地鼠腎細胞的生長狀態。實施例二 雞胚細胞篩選及利用細胞工廠方式培養
在本發明的實施方案中，所述細胞為原代雞胚細胞轉瓶繼代培養一代後；採用ThermoScientific Nunc細胞工廠(10層，培養面積6320cm2，工作容量2000ml)對雞胚細胞進行培養；所用的培養基是M199培養基或DMEM培養基。所用其它試劑包括牛血清、胰酶等。I、將9日齡雞胚去頭、腳後解剖，用胰蛋白酶進行消化，製得原代細胞；嚴格控制PH值為7. 2 ;將蓋有透氣塞的三L轉瓶置於37°C，5%co2環境中培養，三L轉瓶內表面經O. Γ1 mg/ml的多聚賴氨酸包被後,用無Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；換液時間5天，換液時，保留一部分舊培養液，以棄掉1/2，細胞生長至95%匯合階段即按一分為二的原則進行傳代，培養液與液面以上空間的體積比例保持在1:10，加入培養液的高度要控制在4mm。
2、細胞質量篩選措施同實施例一。3、通過上述實施例二 1、2項操作，剔除不合格細胞，然後以1Χ1(Τ6Χ104個細胞/ml的密度接種於Nunc細胞工廠內；在37°C下培養5 8天，培養期間補加新鮮的培養基，使培養基中葡萄糖含量保持在2-2. 5克/升。乳糖濃度，用乳糖脫氫酶法測定；葡萄糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測定，通過葡萄糖消耗來判定雞胚細胞的生長狀態。本發明的特點是
培養用的細胞可以為猴腎細胞、地鼠腎細胞、家兔腎細胞、雞胚細胞、沙鼠細胞、牛腎細胞等原代動物細胞，取材廣泛；
克服了傳統原代細胞培養技術外源汙染的風險高，質量難以控制，制約了生物製品的規模化生產的缺點。批量獲取與篩選保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞，使細胞的生長空間增大，提高了培養效率， 充分利用了培養基中的營養成分；同時，又使細胞在均一的環境下生長，保證了細胞的質量，原代細胞經自組織分離後體外培養不超過5代的繼代擴增，大大降低了活體動物的使用量，將此技術應用於生物製品的生產，將會提高生物製品的產品質量和生產規模及生產效率，既可以造福於人類，又具有巨大的商業價值。
權利要求
1.一種原代細胞大規模繼代培養的方法，其步驟是 (1)批量獲取保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞； (2)對步驟(I)獲取的繼代細胞，進行篩選； (3)利用生物反應器或細胞工廠大規模培養步驟(2)篩選出的繼代細胞。
2.根據權利要求I所述的原代細胞大規模繼代培養的方法，其特徵在於，所述原代細胞是猴腎細胞、地鼠腎細胞、家兔腎細胞、雞胚細胞、沙鼠細胞、牛腎細胞、狗腎細胞中的一種。
3.根據權利要求2所述的原代細胞大規模繼代培養的方法，其特徵在於，在步驟(I)中，來源於動物機體組織的細胞在利用轉瓶培養的方法初代培養成功後，保持其在反覆傳代中不發生轉化或不停止生長其措施是 (I. I)控制pH值為7. 2 7. 4; (I. 2)在5%C02環境中培養； (I. 3)根據原代細胞的種類及分化程度在轉瓶內表面包被膠原、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白； (I. 4)換液間隔時間最長為8天，或連續灌注，換液時，棄掉1/2 2/3舊培養液； (I. 5)細胞生長至75、5%匯合階段即按一分為二的原則進行傳代； (I. 6)培養液與液面以上空間的體積比例保持在1:8 1:12之間，加入培養液的高度控制在8mm以下。
4.根據權利要求2所述的原代細胞大規模繼代培養的方法，其特徵在於，步驟(2)所說的篩選的措施是 (2. I)原代細胞培養物細菌、真菌、支原體、病毒外源汙染檢測； (2. 2)用乳糖脫氫酶法測定乳糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，通過葡萄糖消耗來判定原代動物細胞的生長狀態； (2. 3)細胞損傷檢測，通過細胞損傷檢測來調整批量獲取高活力細胞操作工藝參數。
5.根據權利要求2所述的原代細胞大規模繼代培養的方法，其特徵在於，步驟(3)所說的大規模培養的措施是選取細胞工廠或剪切力小的固定床籃式培養系統生物反應器進行原代細胞大規模繼代培養。
全文摘要
本發明提供了一種原代細胞大規模繼代培養的方法，該方法包括下列步驟a)批量獲取保持其細胞二倍體生物學性狀的、高活力的、適於利用生物反應器或細胞工廠的繼代細胞；b)適於利用生物反應器或細胞工廠細胞的篩選；c)利用生物反應器或細胞工廠大規模培養篩選出的細胞。該方法解決了原代細胞用於生產需要使用大量動物，外源汙染風險高，質量難以控制，規模化生產困難問題，同時也發揮了原代細胞或其繼代細胞在生物製品生產中無傳代細胞系潛在致腫瘤性風險的優勢。
文檔編號C12N5/071GK102965333SQ201210537870
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者李偉, 蘇文全 申請人:李偉, 蘇文全