荷包豬sla-2基因及其應用的製作方法

2023-06-05 06:07:16

專利名稱：荷包豬sla-2基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及我國特色品種荷包豬SLA-2等位基因(SLA-2-HB) cDNA的擴增、序列測 定和分析，以及利用其進行荷包豬品種鑑定及優化遺傳育種。
背景技術：
荷包豬是東北民豬的一個小型類群，分布於遼西封閉山區，因其外形酷似「荷包」 而得名。該品種豬長期自繁自育，自然進化，已有300多年歷史；該品種豬野生性強，具有良 好的抗病能力；另外該品種豬肉質鮮美，味感醇香，俗有「北方香豬」之稱。1987年被農業 部列為國家一級保護豬種，2002年被列入《國家畜禽遺傳資源保護名錄》，2006年被確定為 《國家級畜禽遺傳資源保護品種》，是東北地區唯一得到國家保護的豬種。由於荷包豬還沒 有開發出利用市場，其保種目前完全依靠國家投入，成本昂貴，保種壓力非常大。為了維持 荷包豬數量的穩定，除了自繁自育外，每年要從一些山區農戶收購一些散落的荷包豬。但對 其的品種鑑別和人工繁育都缺乏科學有效的指導，這給荷包豬商品化養殖繁育帶來巨大的 難題。本申請的發明人通過長期對荷包豬資源的調查研究，考慮到該品種獨特的性能和 地位，推測其在進化上也具有獨特的地位和背景。此外，豬的主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC),又禾爾之為豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)，其中SLA-2 (又稱為SLA-B)是一重要的功能基因。Piontkivska等(2003)報導，脊 椎動物的MHC分子代表物種的進化特徵，據此推測豬MHC類分子重要功能基因SLA-2有可 能反映荷包豬的分子進化背景。基於此，本申請的發明人擬從荷包豬的SLA-2基因入手，針 對性地研發準確可靠的品種鑑別方法，並為荷包豬品系優化和培育新品種提供指導性的數 據。

發明內容
本發明的目的之一在於提供荷包豬SLA-2基因序列，發明人通過設計特異性引 物，經RT-PCR擴增荷包豬SLA-2基因cDNA，再克隆至pMD_18T載體，然後測序。結果顯示， 共克隆出荷包豬SLA-2基因的4個等位基因，即SLA-2-HB01 04，其鹼基序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示。本申請的發明人利用RT-PCR擴增得到上述荷包豬SLA-2等位基因，擴增所用的引 物序列是上遊引物Sl :5，-AGATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAG-3，(SEQ ID NO 5)；下遊引物S2 :5，-CAGTCCCCACAAGGC AGCTGTCTC-3，(SEQ ID NO 6)；擴增PCR程序為94"C 5min ；940C 45s，64°C 30s，72°C lmin，3 循環；94°C 45s, 62°C 30s，72°C lmin，3 循環；
940C 45s, 600C 30s，72°C lmin，31 循環；72°C IOmin。本發明的另一目的是提供用於荷包豬品種鑑別及指導遺傳育種的方法。基於上述 克隆得到的荷包豬SLA-2基因的4個等位基因序列，發明人調集DDBJ/EMBL/GenBank上除 荷包豬外其他 44 個 SLA-2 等位基因，利用 Gentyx 9. 0 (Software Development co.，Ltd) 推導基因的胺基酸序列、DNAMAN Version5. 2. 2 (Lynnon Biosoft)對SLA-2各等位基因進 行序列對比，最後通過Mega2(Mega software Co. , Ltd)的neighbor-joining法繪製各基 因的分子進化圖譜。通過分析荷包豬SLA-2-HB的基因分子特徵，即特徵性胺基酸位點，發明人發現荷 包豬SLA-2-HB基因在其編碼區的47位、48位、67位、68位、74位、97位、119位、138位、240 位均為特徵性胺基酸，具體信息如下表
權利要求
荷包豬SLA 2基因，包括4個SLA 2等位基因，其鹼基序列如SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
2.權利要求1所述的荷包豬SLA-2基因，其特徵在於利用RT-PCR擴增荷包豬SLA-2基 因，擴增所用的上、下遊引物序列分別如SEQ ID NO :5和SEQ IDNO :6所示；擴增PCR程序 為940C 5min ；940C 45s，64°C 30s, 72°C lmin，3 循環；94°C 45s, 62°C 30s, 72°C lmin，3 循環；94°C 45s, 60°C 30s, 72°C lmin，31 循環；72°C IOmin。
3.權利要求1所述的荷包豬SLA-2基因在荷包豬品種鑑別上的應用。
4.權利要求3所述的荷包豬SLA-2基因在荷包豬品種鑑別上的應用，是根據荷包豬 SLA-2基因編碼區的特徵性胺基酸位點進行鑑別，其特徵在於所述的特徵性胺基酸位點位 於SLA-2基因編碼區的47位(F)、48位(I)、67位(A)、68位⑷、74位(Q)、97位(N)、119 位(I)、138 位(R)、240 位(S)。
5.權利要求1所述的荷包豬SLA-2基因在荷包豬優化遺傳育種上的應用。
全文摘要
荷包豬SLA-2基因及其應用，包括對我國特色品種荷包豬包括4個SLA-2等位基因cDNA的擴增、序列測定和分析。所述的4個SLA-2等位基因鹼基序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。這些基因序列及以此為基礎所得到的基因分子特徵及分子進化圖譜可用於荷包豬基因庫的構建、荷包豬的品種鑑別及指導荷包豬的遺傳育種。
文檔編號C12Q1/68GK101984058SQ20101054519
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者許崇波, 高鳳山 申請人:大連大學