一種檢測tpd52l1蛋白的試劑盒及其製備方法
2023-06-23 17:18:21 1
一種檢測tpd52l1蛋白的試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測TPD52L1蛋白的試劑盒及其製備方法，涉及化學發光免疫分析【技術領域】，為解決目前TPD52L1蛋白超微量檢測的技術問題，根據本發明的試劑盒包括：1)TPD52L1蛋白校準品；2)鏈親和素偶聯的固相載體；3)生物素化的TPD52L1蛋白配體；4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記的TPD52L1蛋白配體；以及5)所作用的化學發光底物。進一步，根據本發明製備上述試劑盒的方法。本發明主要用途為TPD52L1蛋白超微量檢測。
【專利說明】—種檢測TPD52L1蛋白的試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及化學發光免疫分析【技術領域】，特別涉及一種檢測TTO52L1蛋白的試劑盒及其製備方法，結合了生物素-親和素免疫放大技術和化學發光免疫分析技術。
【背景技術】
[0002]TPD52L1蛋白是由TTO52L1基因編碼表達的蛋白，是D52系列基因家族的一員，在人類乳腺癌細胞中表達。編碼蛋白包含一個捲曲螺旋域。在細胞增殖和鈣信號蛋白質起作用。它還交互絲裂原活化蛋白激酶激酶5(MAP3K5/ASK1)和積極調節MAP3K5，誘導細胞凋亡。在科研和生產過程中，需要測定溶液中TTO52L1蛋白含量變化，來監控實驗條件和監控生產過程。
[0003]目前TPD52L1蛋白測定方法有膠體金免疫層析(GICA);蛋白質印跡(WB);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，化學發光法免疫分析(CLIA) ;GICA、ELISA、WB的優點是相對成本低廉，缺點是靈敏度低，TPD52L1蛋白含量少的情況下檢測不出，CLIA檢測靈敏度比上述方法高，但還是不能滿足科研上對TPD52L1蛋白超微量檢測的需要。為了適應科研和生產上對檢測靈敏度的更高要求，需要對化學發光技術進行創新。
[0004]1977年，Halmann將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應結合起來，建立了化學發光免疫分析法(CLIA)。經過幾十年的發展。目前根據標記物的不同，化學發光免疫分析可分以下四個類型:(I)以辣根過氧化物酶(HRP)為標記物的酶促化學發光系統。該系統的發光底物為魯米諾及其衍生物，在氧化劑存在下，HRP催化魯米諾及其衍生物發光，波長425nm。苯酚類化合物可增強其發光強度；(2)以鹼性磷酸酶為標記物的酶促化學發光系統。該系統的發光底物為1，2—二氧環乙烷衍生物(或稱金剛烷衍生物)。例如 AMPPD, CSPD, CDP-Star, Lum1-phos480, Lumiphos-530 等。表面活性劑會增強並延長其發光強度，發光波長470nm;(3)以吖啶酯類為標記物的化學發光系統。該系統採用直接標記吖啶酯類發光劑，吖啶酯類發光劑在鹼性H2O2作用下直接發光，波長430nm處吖啶酯類發光系統發光強度高；(4)以三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+為標記物的電化學發光系統。是通過施加一定的電壓進行電化學反應，在電極表面產生電生物質，然後電生物質與體系中三丙胺(TPA)之間通過電子傳遞形成激發態，之後激發態的能量以光的形式釋放出來.在波長350?420nm處發光強度高。
[0005]1982年，Ikarlyama等以氯化血紅素代替辣根過氧化酶(HRP),用碳二亞胺法將其標記在人體血清白蛋白(HSA)上，結合酶免疫分析技術，對HSA的化學發光免疫測試進行了初步探討。他們這一開創性的研究，為金屬卟啉在酶免疫分析中的應用奠定了基礎。
[0006]1984年，Hara等將鐵卟啉配合物標記於HSA抗體上用於檢測HSA，並將這一體系應用於分析化學中。
[0007]1992年，Adam等對鐵卟啉和錳卟啉的催化機理進行的研究，並與辣根過氧化酶的催化發光效應進行了比較。
[0008]1993年，Motsenbocker等用光敏劑和金屬卩卜啉標記抗體進行免疫檢測。[0009]1994年，慈雲祥等課題組對於金屬卟啉催化劑替代辣根過氧化酶催化化學發光反應也進行了一些探索。
[0010]2006年，Komagoe等卟啉誘導的光學生成過氧化氫的測定，用魯米諾發光法:在水溶液中與卟啉聚集的一個結構活性關係進行研究。
[0011]2006年，Rana等電化學產生過氧化氫和卩卜啉化學發光法進行了嘗試。
[0012]2006年，李春豔等四苯基卟啉鋅摻雜8-羥基喹啉鋁與四苯基聯苯二胺的電致發光性能進行了研究。
[0013]2007年，劉波等發光材料四苯基卟啉及其金屬配合物的合成及性能進行了研究。
[0014]2008年，吳俊等卟啉摻雜MEH-PPV的發光性能進行了探討。
[0015]2011年，D Wu等新型化學發光流動注射分析減少其對魯米諾-間-四(3_甲氧基-4-羥基)苯基卟啉錳催化過氧化氫的反應進行了研究。
[0016]2012年，Kazemi等對動力學化學發光猛(III)-四(4_磺酸)P卜啉魯米諾過氧化氫體系的人和牛血清白蛋白的影響進行了研究探索。
[0017]上述研究，主要在卟啉類標記物替代辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶及其他酶促化學發光技術，在過氧化氫等過氧化物，魯米諾及魯米諾衍生物為底物基礎上進行的探索，取得一些效果，但沒有滿足科研方面對超微量檢測的需求。我們通過實驗發現水溶性的5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉在促進吖啶酯和吖啶磺醯胺在非鹼性條件下的化學發光效果方面明顯優於上述四種常用化學發光常見系統及文獻報導，能夠提高對超微量被測物的檢測能力。
[0018]吖啶酯類發光劑標記物合成後，會有微量發光劑在沒有鹼性條件刺激下緩慢發光，這點也影響了其長期穩定性及對緩衝液的選擇性。5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉化學結構非常穩定，且對酸鹼PH值適應的範圍寬，可長期穩定保存。
[0019]同時，目前沒有發現5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標記物，吖啶酯，吖啶磺醯胺為底物的化學發光法檢測TTO52L1蛋白的研究及報導。
[0020]生物素-親和素系統(biotin-avidin system,BAS)具有多級的信號放大作用，並且不增加非特異性幹擾，且具有特異性好、穩定性高、和實驗成本低等特點。
[0021]本發明結合BAS技術，首次提出採用水溶性5，10，15-三(4_吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標記物構建化學發光免疫檢測TTO52L1蛋白的方法，該方法集合了 CLIA靈敏度、BAS放大作用和5，10，15-三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉穩定性，克服了傳統CLIA法靈敏度無法滿足科研超微量研究的弊端，本發明試劑盒的高靈敏度，穩定性方面5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標記物明顯好於常規直接標記吖啶酯，吖啶磺醯胺標記物，發光信號更強，對於檢測超微量物質提供了 一個全新的化學發光技術方法。
【發明內容】
[0022]本發明克服了當前化學發光法不能滿足對TTO52L1蛋白超微量檢測的技術問題，即通過生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光技術和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標記物構建化學發光免疫分析高靈敏度檢測TPD52L1蛋白，提供了一種檢測TTO52L1蛋白的試劑盒及其製備方法。
[0023]本發明採用的技術方案是:[0024]本發明的目的是提供一種生物素-親和素免疫放大技術結合化學發光技術和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標記物方法，檢測TTO52L1蛋白的試劑盒。
[0025]本發明的再一目的是提供一種製備上述試劑盒的方法。
[0026]根據本發明的試劑盒包括:l)Tro52Ll蛋白校準品；2)鏈親和素偶聯的固相載；3)生物素化的TPD52L1蛋白配體:4)5,10,15-H (4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記的TTO52L1蛋白配體；以及5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學發光底物。
[0027]根據本發明的試劑盒，其中，所述TPD52L1蛋白為TTO52L1基因編碼表達的蛋白。
[0028]根據本發明的試劑盒，其中，所述TPD52L1蛋白校準品為TPD52L1蛋白配製的校準品凍幹品，校準品內所用的保護基質蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白。
[0029]根據本發明的試劑盒，其中，所述鏈親和素偶聯的固相載體為磁性顆粒，塑料顆粒。
[0030]根據本發明的試劑盒，其中，所述TPD52L1蛋白配體為可以與TPD52L1蛋白特異性結合反應的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體、蛋白質、大分子有機化合物。
[0031]根據本發明的試劑盒，其中，所述5，10，15_三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉結構
式如⑴所示:
【權利要求】
1.一種檢測TPD52L1蛋白的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括: DTPD52L1蛋白校準品； 2)鏈親和素偶聯的固相載體； 3)生物素化的TTO52L1蛋白配體； 4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記的TPD52L1蛋白配體；以及 5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學發光底物。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述TTO52L1蛋白為TTO52L1基因編碼表達的蛋白。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述TTO52L1蛋白校準品為TTO52L1蛋白配製的校準品凍幹品，校準品內所用的保護基質蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述鏈親和素偶聯的固相載體為磁性顆粒，塑料顆粒。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述TPD52L1蛋白配體為可以與TPD52L1蛋白特異性結合反應的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體、蛋白質、大分子有機化合物。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉結構式如(I)所示:
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記的TPD52L1蛋白配體所用的偶聯劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，N，K - 二環己基碳二亞胺(DCC)。
8.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學發光底物為吖啶酯、吖啶磺醯胺。
9.一種製備權利要求1所述試劑盒的方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)以TPD52L1蛋白純品配製TPD52L1蛋白校準品； 2)使鏈親和素偶聯固相載體；3)使TPD52L1蛋白配體生物素化； 4)用5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記TPD52L1蛋白配體； 5)配製化學發光底物液； 6)分裝上述TPD52L1蛋白校準品、鏈親和素偶聯固相載體、生物素化的TPD52L1蛋白配體、5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記的TTO52L1蛋白配體和化學發光底物液；以及 7)組裝為成品。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述製備TPD52L1蛋白校準品的步驟I)採用以下方法: 配製含牛血清白蛋白2%，卵清蛋白1.5%，水解明膠0.5%，2.5%蔗糖的0.01M PB緩衝溶液為校準品基質液，用基質液配製含不同濃度TTO52L1蛋白的校準品，用西林瓶分裝.1mL/瓶，凍幹處理後，_20°C保存。
11.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述製備鏈親和素化固相載體的步驟2)採用以下磁性顆粒方法: 250mg氨基末端磁性顆粒置於燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反覆清洗，磁性分離，棄去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置於恆溫振蕩器，反應IOh,最後將反應後的磁性顆粒用丙酮及超純水反覆清洗6遍,取新製備經PDITC活化的磁性顆粒置於30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置於恆溫振蕩器中反應.20min，磁性分離，測定反應前後溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
12.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述製備鏈親和素化固相載體的步驟2)採用以下塑料顆粒方法: 250mg氨基末端塑料顆粒置於燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反覆清洗，離心分離，棄去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置於恆溫振蕩器，反應10h，最後將反應後的塑料顆粒用丙酮及超純水反覆清洗6遍，取新製備經PDITC活化的塑料顆粒置於30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置於恆溫振蕩器中反應.20min，離心分離，測定反應前後溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
13.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述製備TTO52L1蛋白配體生物素化的步驟3)採用以下方法: 將生物素-N-羥基磺酸基琥珀醯亞胺酯(Sulf0-NHS-Biotin)冰箱取出平衡至室溫。.0.01M的PBS稀釋TPD52L1蛋白配體至濃度2mg/mL。稱取Sulfo-NHS_Biotin2mg於西林瓶中加超純水300 μ L，輕輕搖勻活化。立即將活化的生物素溶液54 μ L緩慢加入2mLTPD52Ll蛋白配體溶液中，室溫反應30min，反應液用0.01M的PBS透析4°C 8h (換液4次)，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
14.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述製備5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯標記TTO52L1蛋白配體的步驟4)採用以下方法: 將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)冰櫃取出平衡至室溫，取10mg5，.10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉和20mgEDC分別溶於Iml超純水中使其溶解，將兩者在4°C混合攪拌反應30min，然後向此混合液中緩慢滴加入含30mg/mL TPD52L1蛋白配體溶液，室溫攪拌反應2h，層析純化後，-20°C保存。
【文檔編號】G01N33/68GK103575898SQ201210253672
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月23日 優先權日:2012年7月23日
【發明者】陳秀髮, 李勇, 徐海偉, 胡慶鋒, 常立峻 申請人:蘇州長光華醫生物試劑有限公司