桉樹pgef12基因及其植物表達載體、宿主細胞和應用的製作方法

2023-05-24 00:32:11

專利名稱：桉樹pgef12基因及其植物表達載體、宿主細胞和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因及其應用，特別是涉及桉樹PGEF12基因及其植物表達載體、宿主細胞和其在促進植物營養生長和提高植物生長量上的應用。
背景技術：
林木在淨化大氣、防風固沙、保持水土、維持生態平衡和生物多樣性、提供優質木材和高產優質林果等方面發揮著重要的作用，具有巨大的生態效益、社會效益和經濟價值。林木等木本植物基因資源豐富，遺傳多樣性複雜，帶有許多具有潛在應用價值但目前尚未得到充分發掘和有效分離的基因。近年來隨著分子生物學、分子遺傳學、基因組學和生物信息學等學科的發展，文庫構建和篩選技術、基因克隆技術和高通量測序技術等技術的建立
和改進，越來越多的林木基因得到分離和鑑定，為林木的分子育種與以及林木優良基因的發掘和應用奠定了基礎(李少鋒等人，植物學報46(1): 79-107(2011))。目前，對已分離的林木基因的功能鑑定主要採用以下方法1)與模式植物的同源基因或功能已經過鑑定的基因進行相似性比較，建立進化樹；2)對蛋白質結構與和功能進行預測分析；3)通過轉錄水平或蛋白表達水平的分析方法，例如半定量或定量RT-PCR、Western Blotting等，研究目的基因的時空表達以及對環境因子的響應；4)把基因的與適當的元件相連接製作成表達盒，並組裝到相應的植物表達載體，通過遺傳轉化技術將表達盒轉化到模式植物或來源物種中，從而改變目標基因在宿主中的表達量，如因過量表達而表達上調，或因反義抑制或者RNA幹擾而表達下調，並而通過觀察轉基因植株的性狀，研究基因的功能(何光源等人，植物基因工程，清華大學出版社(2007);王關林等人，植物基因工程，科學出版社(2009))。對於模式植物，一般選用為擬南芥(Arabidopsis thaliana)或者菸草(Nicotianatabacum)。 Mouradov 等(Proceedings of the National Academy of Sciences 95:6537-6542 (1998))將在輻射松(Pinus radiata)的/^方規7 OVZ7)，一個與擬南芥的Z說/TUFY) /FLORICAULA基因高度同源的基因轉入擬南芥，發現轉入的植株可以互補發育途徑中對應基因的LFY缺失，從而表明NLY與FLY的在功能上的相似性。Sonoda等(Plant Biotechnology 26: 115-120 (2009))將赤桉HD-Zip class II 轉錄因子EcHBl 基因轉入菸草，轉基因植株纖維長度和乾重增加，葉片、根和莖的生長量均高於對照。這兩種植物的遺傳背景清楚，遺傳轉化系統也較為成熟，尤其是擬南芥，作為基因組最早被測序的植物，其基因組序列、代謝途徑以及生長發育的分子機制等方面有大量的研究，能為轉基因後代的性狀和機理分析提供較為完善的參考數據。因此，通過遺傳轉化模式植物的方法鑑定基因功能的結果可信性高，所得的結果距離分子育種的應用比較接近。桉樹是桃金孃科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)的總稱。作為一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用於一體的優良樹種，桉樹由於其生長速度快、移栽成活率高等優點，得到廣泛的種植。通過分子生物學及基因組學手段篩選及鑑定桉樹的優良基因，並從中發掘具有能促進植物營養生長和提高植物生物量應用價值的基因，除了可通過基因工程改造獲得高產優良桉樹品種奠定基礎外，還可以為其他林木、蔬菜及作物的分子育種提供優良的基因資源。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種桉樹PGEF12基因及其植物表達載體、宿主細胞和在促進植物營養生長和提高植物生長量上的應用，以有效促進植物營養生長，提高植物生物量。為解決上述技術問題，第一方面，本發明提供一種桉樹PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特徵
核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 編碼胺基酸序列為SEQ ID NO:2的多肽。第二方面，本發明還提供一種植物表達載體，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因 或其片段。進一步地，所述植物表達載體為pCAMBIA1301。優選地，所述植物表達載體為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl2。第三方面，本發明還提供一種宿主細胞，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段或者如上任一項所述的植物表達載體。進一步地，所述宿主細胞選自大腸桿菌、農桿菌或植物細胞。在一個優選實施方案中，所述宿主細胞選自大腸桿菌Transl-Tl菌株、農桿菌GV3101菌株或雙子葉植物的細胞。第四方面，本發明還提供一種如上所述的基因、植物表達載體或宿主細胞在促進植物營養生長和提高植物生物量方面的應用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達載體轉化入植物，或者用所述宿主細胞感染植物。在一個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化後代與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，葉片等營養器官的生長得到促進，表現為葉片數增多，植株直徑增大，同時地上部分生長量得到提高。在第二個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化後代與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，根的生長得到促進，表現為根的長度增加。在第三個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化後與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，在組培條件下營養生長得到促進，生長量得到提高。通過採用上述技術方案，本發明具有以下有益效果通過實驗證實，本發明提供的源於桉樹的PGEF12基因及其編碼的多肽具有促進植物營養生長和提高植物生物量的功能。具體來說，在植物中提高PGEF12的表達量可以增加植物葉片數、植株直徑，促進根的生長，以及提高生物量。與現有技術相比，本發明的技術方案可應用於提高林木、蔬菜和經濟作物的產量。
上述的營養生長是指植物在發育的營養期(Vegetative Phase of Development)的生長發育過程。這個過程從胚胎發生開始，一直延續至植物的整個生長周期，包括種子萌發和幼苗形成、根和莖的延長和分支、葉片的形成與延伸，以及根和莖的次生加厚(Taiz等人，Plant Physiology, Sinauer Associates,第三版(2002) ；Leyser 等人，Mechanismsin Plant Development, Blackwell Science Ltd. (2003)X



圖I是PGEF12編碼的多肽的胺基酸序列利用NCBI網站的⑶-Search檢索蛋白保守域資料庫(CDD v3. 05 - 42589 PSSMs)輸出的結果。圖2是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥植株在移栽後28天的地上部分生長狀況對比照片。圖3是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥植株在移栽後28天的蓮座直徑和葉片數統計柱狀圖。圖4是未轉化的Col-O擬南芥根生長狀況的照片。圖5是過表達PGEF12擬南芥植株根生長狀況的照片。圖6是是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥幼苗的根長統計柱狀圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例並參照附圖對本發明進行更詳細的說明。應該理解的是，以下所述的實施例僅是用於說明而不是限制本發明。一、PGEF12基因的克隆與序列分析
I.桉樹cDNA的製備
選取新鮮的桉樹(Mucalyptus)葉片，例如桉屬尾巨桉品種DH32-29 {EucalyptusurophyllaXgrandis cv DH32-29)葉片,迅速放入液氮中冷凍,然後放入-80° C超低溫冰箱(SANY0，MDF-382E)中保存備用。根據現有的十六燒基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)提取法(Chang 等人，Plant Molecular Biology Reporter 11(2): 113-116 (1993))提取桉樹葉片總RNA。使用不含RNA酶的DNA酶(Takara，目錄號D2270A)處理提取的RNA以清除裡面混雜的的基因組DNA。取約5 U g的桉樹葉片組織總RNA,採用反轉錄試劑盒，如Invitrogen公司的SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (目錄號 18080-051),合成桉樹cDNA (DNA序列如SEQ ID NO: I所示)。合成的cDNA於-20° C保存備用。2.聚合酶鏈式反應法擴增PGEF12基因
根據聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法(Mullis 等人，ColdSpring Harbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986)),使用高保真熱聚合酶，如 invitrogen 的 Platinum Pfx DNA Polymerase (目錄號11708-039)或者T0Y0B0的KOD FX (目錄號KFX_101X5)，設計帶有含酶切位點接頭的引物，所述引物對應的序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4，以上述桉樹cDNA為模板，克隆PGEF12基因。PCR產物可在1%瓊脂糖凝膠電泳後切下目的條帶，並使用TaKaRa的MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (目錄號D823A)回收純化。回收的片段使用平末端克隆試劑盒連接到克隆載體，例如pEASY-Blunt Cloning Kit (全式金，目錄號CB101)，轉化大腸桿菌後，將陽性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測序。選取測序正確的單菌落保存。3. PGEF12基因保守區域分析
使用諸如 CD-Search (保守結構域搜索(Conserved Domain Search) ；Marchler-Bauer等人，Nucleic Acids Research 39 (D) : 225-229 (2011);也參見美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)國立醫學圖書館(National Libraryof Medicine, NLM)的國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的全球資訊網網址上對CD-Search及保守結構域資料庫(Conserved DomainDatabase)的解釋)之類的分析工具，對PGEF12編碼的多肽序列(胺基酸序列為SEQ IDNO:2)進行保守結構域分析。圖I展示了利用⑶-Search以一種算法在⑶D資料庫裡面檢索的結果。
二、PGEF12過表擬南芥植株的獲得及其地面部分營養生長狀態的觀察
1.重組載體pCAMBIA1301-PGEF12的構建
通過使用工具酶進行質粒雙酶切、目的片段回收和連接，將PGEF12克隆至植物表達載體，如PCAMBIA1301，使得該基因位於啟動子如CaMV 35S啟動子的控制下。按照以下操作方法實施，詳細的步驟可根據本領域技術人員已知的方法進行修改使用SanPr印柱式質粒小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司，目錄號SK8192)從上述轉化的大腸桿菌中提取含有PGEF12的重組質粒，使用限制性內切酶汝~/11(NEB,目錄號(NEB,目錄號R0532)進行雙酶切;另取pCAMBIA1301質粒，使用BgIll和&7I進行雙酶切。酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別切下大小約為800bp的PGEF12和大小約為10000 bp的pCAMBIA1301骨架條帶，並使用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (Takara,目錄號D823A)回收。將上述兩個片段按照PGEF12:pCAMBIA1301的摩爾比為3:1混合，使用T4 DNA連接酶(Fermentas，目錄號#EL0011)進行連接後轉化大腸桿菌，將陽性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測序。選取測序正確的單菌落使用SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒，所得的質粒即為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl2。2.擬南芥的遺傳轉化及轉化後代的篩選
2.I含有重組載體pCAMBIA1301-PGEF12的根癌農桿菌GV3101細胞的製備
按照本領域技術人員熟知的方法(Wang等人，Agrobacterium Protocols, HumanPress,第2版(2006))，製備根癌農桿菌GV3101的感受態細胞，並使用熱激轉化法將重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2轉化根癌農桿菌，製備含有pCAMBIAl301-PGEFl2的根癌農桿菌GV3101 細胞。2. 2擬南芥的遺傳轉化及轉化後代的篩選
取擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型Columbia-O (Col-O)種子，以本領域技術人員熟知的方法(Weigel D 等人，Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (2002))將種子播種在培養土進行種植。種植環境溫度20-23°C，溼度 70-85%，光照 16 h/天，光照強度 4500 Lux。
以現有的蘸花浸染法(Zhang等人，Nature Protocols 1(2): 641-646 (2006))轉化擬南芥及從後代中篩選陽性植株。根據該方法，轉化後當代收穫的種子為Tl代轉基因種子。取擬南芥Tl代轉基因種子消毒後在含有50 mg/L潮黴素B (Hygromycin B),l%鹿糖和 0. 8 g/L 的 Murashige and Skoog 培養基(MS 培養基；Murashige 等人，PhysiologiapIantarum 15(3) : 473-497 (1962))上篩選培養12天，能正常生長發育的幼苗即為轉基因陽性Tl代植株。將轉基因陽性Tl代植株幼苗小心轉移到培養土上，於上述培養條件中培養，植株成熟後收穫的種子即為T2代轉基因種子。為了進一步確認陽性轉基因植株，可使用PCR法(Mullis等人，Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986))對篩選得到的陽性植株進行分子鑑定。在幼苗長出8-10片葉片後，取一片約I cm長的葉片提取基因組DNA作為模板，設計擴增超黴素磷酸轉移酶基因(Hygromycin phosphotransferase, hpt)的特異引物，如hpt-F3 (SEQ ID N0:5WPhpt-R3 (SEQ ID NO:6)對hpt基因進行擴增，能成功擴增出約750 bp條帶的樣品對應的植株可確定為陽性轉基因植株。 3. PGEF12過表擬南芥植株地面部分生長狀態的觀察
取上述T2代轉基因種子，消毒後在含有25 mg/L潮黴素B，1%蔗糖和0.8 g/L瓊脂的的MS培養基上篩選培養12天，能正常生長發育的幼苗即為轉基因陽性T2代植株。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒後在營養成分相同但不含潮黴素B的MS培養基上培養12天，作為對照。選取形態正常的陽性轉基因幼苗和對照幼苗分別小心轉移到培養土上，於前述的培養條件中培養。移栽28天後統計植株蓮座直徑和葉片數(樣本量>15)，並拍下生長狀況的照片。根據統計，過表達PGEF12的擬南芥轉化後代(PGEF12-T2)植株相比起未轉化的Col-O植株，蓮座直徑和葉片數均有顯著增加，如圖2所示。其中蓮座直徑PGEF12-T2為7. 0±0. 7cm, Col-O 為 5. 2± I. I cm ;葉片數 PGEF12-T2 為 18. 9±2. 6 片，Col-O 為 14. 5±3. 8 片，如圖3所示。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株在這兩個指標上有明顯提聞。三、PGEF12過表達擬南芥植株根系生長表型
過表達PGEF12的擬南芥轉基因種子可根據以上所述的方法獲得。並可使用垂直平板檢測分析過表達PGEF12的擬南芥植株根系生長表型。取上述T2代轉基因種子，消毒後點播於有25 mg/L潮黴素B，0. 5%蔗糖和0. 8至1% Phytagel的垂直MS培養基平板上，每個平板點10個種子。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒後點播於相同營養成分但不含潮黴素B的垂直MS培養基平板上，每個平板點10個種子，作為對照。接種後的平板擺放在溫度20-23°C，溼度70-85%，光照16 h/天，光照強度2000 Lux的環境中培養。培養12天後統計幼苗的根長(樣本量>15)，並拍下生長狀況的照片。如6所示，根據統計，PGEF12-T2幼苗根長為4. 6±0. 4 cm, Col-O幼苗根長為3. 2±0. 6 cm。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株幼苗的根長有顯著增加。四、PGEF12過表達擬南芥植株無菌培養條件下的生長狀態 過表達PGEF12的擬南芥轉基因種子可根據以上所述的方法獲得。取上述T2代轉基因種子，消毒後在含有25 mg/L潮黴素B，1%蔗糖和0.8 g/L瓊脂的的MS培養基上篩選培養12天，能正常生長發育的幼苗即為轉基因陽性T2代植株。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒後在營養成分相同但不含潮黴素B的MS培養基上培養12天，作為對照。選取形態正常的陽性轉基因幼苗和對照幼苗分別小心轉移到培養瓶中， 所述的培養瓶為直徑8 cm、高12 cm的玻璃廣口瓶，內有60 ml含有1%蔗糖和0. 8 g/L瓊脂的的MS培養基，使用通氣的瓶蓋。培養瓶擺放在溫度20-23°C，溼度70-85%，光照16 h/天，光照強度3500 Lux的環境中培養。培養35天後統計植株的鮮重(樣本量>15)。根據統計，？6已卩12-丁2植株鮮重3.44±0.5 g, Col-O植株鮮重2. 88±0. 3 g。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株在組培條件下，生物量(鮮重)有顯著增加。
權利要求
1.一種桉樹PGEF12基因，其特徵在於，其cDNA序列具有如下特徵 具有SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 其編碼具有SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列的多肽。
2.一種植物表達載體，其特徵在於其包含如權利要求I所述的桉樹PGEF12基因或其片段。
3.根據權利要求2所述的植物表達載體，其特徵在於所述植物表達載體為PCAMBIA1301。
4.根據權利要求3所述的植物表達載體，其特徵在於，所述植物表達載體為重組載體pCAMBIAl30I-PGEFl2。
5.一種宿主細胞，其特徵在於包含如權利要求I所述的桉樹PGEF12基因或其片段或者如權利要求2 4中任一項所述的植物表達載體。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特徵在於所述宿主細胞選自大腸桿菌、農桿菌或植物細胞。
7.—種如權利要求I所述的基因在促進植物營養生長和提高植物生物量方面的應用，其特徵在於，將所述基因或其片段轉化入植物。
8.—種如權利要求2或3或4所述的植物表達載體在促進植物營養生長和提高植物生物量方面的應用，其特徵在於，將所述植物表達載體轉化入植物。
9.一種如權利要求5或6所述的宿主細胞在促進植物營養生長和提高植物生物量方面的應用，其特徵在於，用所述宿主細胞感染植物。
全文摘要
本發明提供一種桉樹PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特徵具有SEQIDNO:1所示的DNA序列；或者其編碼具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的多肽。本發明還提供一種植物表達載體，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段。本發明還提供一種宿主細胞，包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段或如上所述的植物表達載體。本發明還提供上述基因、植物表達載體或宿主細胞在促進植物營養生長和提高植物生物量方面的應用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達載體轉化入植物，或者用所述宿主細胞感染植物。通過在植物中提高PGEF12的表達量可增加植物葉片數、植株直徑，促進根的生長，以及提高生物量。本發明的技術方案可應用於提高林木、蔬菜和經濟作物的產量。
文檔編號C07K14/415GK102757970SQ20121027122
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者孫長斌, 李奕恆, 許文釗 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司