用於分析電泳和製備電泳的介質的製作方法
2023-06-08 22:30:51
專利名稱：用於分析電泳和製備電泳的介質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於分析電泳和製備電泳的介質。
在高壓電泳下形成pH梯度的這類水溶液廣泛用於蛋白質和肽的分析中。這類已知的溶液包含具有兩性性能的聚合電解質，並且通常通過羧酸與聚胺的縮合或聚合來合成製備。在合成時，產生許多分子量不同和酸性基團(羧基)和鹼性基團(氨基或亞氨基)數目不同的化合物。在高壓電泳條件下，這些聚合電解質由於其酸性和鹼性基團的比例不同而這樣排序，即具有特別的酸性性能的聚合電解質濃集在陽極附近，而所有其它的聚合電解質根據其酸性或鹼性性能的「等級」排列在電極之間，並因此而濃集。通過聚合電解質按其各個物質的酸性或鹼性性能的選擇性濃集在整個水溶液內部形成pH梯度。
藉助於該pH梯度，兩性化合物，例如蛋白質和肽可以根據該不同的酸性或鹼性性能達到分離。這種分析性分離方法在文獻中被稱作「等電點聚焦」。如果該方法在特定的凝膠(聚丙烯醯胺)中進行，那麼該方法被稱作PAGIEF(在聚丙烯醯胺凝膠上的IEF)，並被視作標準方法。
在市售的兩性物合成時使用的不飽和酸例如取代的丙烯酸是有劇毒的，其殘餘量被認為是有危害的。
出於該理由，禁止使用市售的兩性物來純化隨後用於人類的蛋白質。
在合成該兩性物時，產生許多未知結構的化學物質，其相對濃度按批號差異很大。因此對分析結果的再現有不利影響。
在某些應用中，報導過在兩性物和分析物之間所不希望的配合物導致的「人造條帶」。
也報導過具有高分子量的兩性物對蛋白質的分析顯色反應的部分幹擾。多次報導過在某些製造商的產品中有異常高含量的MG(分子量)＞10KD的兩性物。
在蛋白質的製備性純化情況下，隨後的兩性物的分離是困難的，並且有時是不完全的；據推測可能的原因是這裡形成了配合物。
已經證明市售的兩性物不適合於作為用於生物顆粒的分離介質，因為該生物顆粒聚集在介質中。
本發明的目的是提供一種用於等電點聚焦(IF)的含有不同pKs值的酸和鹼的水溶液，其不具有上述缺陷，並因此明顯拓寬了其應用範圍。
本發明的目的是通過權利要求1的水溶液達到的。其它有利的實施方案由隨後的權利要求2至7給出。
本發明的水溶液包括具有成梯度的酸度和/或鹼度的酸和鹼的混合物。各個酸的pKs值在pKs3.5至pKs12之間變化，並且「相鄰」酸的pKs-值的差值(ΔpKs)應該不大於ΔpKs＝1。理想的值是ΔpKs＜0.8。
所用鹼的pKs值在pKs＝1.5至pKs＝11之間變化。當各個鹼的差值ΔpKs＜0.8時是理想的。
所使用的酸和/或鹼的數目和其相關濃度決定pH-梯度的範圍和分布(Profil)。最低數目是各2種酸和/或2種鹼，優選是3種酸和/或3種鹼。在pH值範圍寬(pH2.5至10)的情況下，使用具有成梯度的pKs的11種酸和13種鹼。
在所附的附
圖1至3中，描述了各為三種常規酸和鹼的模型中的電泳遷移和因此產生的pH梯度的形成。下面的酸∶羥基丁酸(HIBA(pKs＝3.8))，HEPES(pKs＝7.5)和2-羥基吡啶(pKs＝11.6)和下面的鹼∶牛磺酸(pKs＝1.5)、蜜胺(pKs＝5)和ammediol(pKs＝9)以不同的濃度存在於起始溶液中(參見附圖1)。一般規則是，與較強的酸和鹼的濃度相比，不但非常弱的酸而且非常弱的鹼的相對濃度明顯升高(約5倍)。「中等強度」的酸和鹼的濃度升高至約1.5倍至最大3倍。
在附圖2和3中，描述了電泳移動之後上述酸和鹼的相對濃度。在所述的「平衡狀態」中，形成酸和鹼「對」，它們僅以非常低的程度相互電離(強酸-HIBA+非常弱的鹼-牛磺酸，弱酸-HEPES+弱鹼-蜜胺和強鹼-Ammediol+非常弱的酸-2OH-吡啶)，並且因此介質本身的物質的電泳遷移停頓。在這些對的區域中，在每種情況下產生一相應於酸和鹼的pKs值的算術平均值的pH值。因此，這些對的pH值是HIBA/牛磺酸溶液pH＝2.6，HEPES/蜜胺pH＝6.25，2-OH-吡啶/AmmediolpH＝10.3。其中對可以確保穩定的pH值的pH範圍是約1pH單元。只要各個酸和鹼的絕對濃度在平衡狀態下確保足夠的緩衝能力，則所有其它的具有不同pKs值的酸和鹼就構成同樣在一個pH單元內確保穩定的pH值的對。
本發明的溶液由詳知其性能的確定的化學物質組成。通過製備時所使用的天平的精密性和準確性來保證整個混合物的再現性。所使用的物質是無毒的。所使用的每一種物質是「單官能」的，也就是說根本不存在如形成配合物或生物高分子聚集的結果，或者與具有多官能基團的聚合電解質相比這種作用至少明顯降低。該混合物中所有各個組分的分子量總計＜300道爾頓。
已經成功地證明本發明的水溶液可以作為用於生物聚合物和生物顆粒的分離介質，並且認為具有生物相容性。因為大部分各個組分可以通過具有類似pKs值的化學物質替代，所以通過改變該組合物的組成可以顧及生物顆粒對該分離介質的特定要求。出於該理由，官方可能許可該溶液用於隨後在人體中用的生物顆粒和生物聚合物(肽和蛋白質)的純化。
下面舉例說明本發明的具有不同pH-間隔的水溶液。這裡要注意，在製備用於窄的pH間隔的介質時，酸和鹼的絕對濃度升高；一般也可以通過使用新組分來降低pKs值的差。
實施例1(pH-間隔3-10)
實施例2(pH-間隔4-6)
實施例3(pH-間隔5.5-7.5)
實施例4(pH-間隔8-11.5)
實施例5(pH-間隔2.5-5)
在所述的介質中產生大部分呈線性的pH梯度。在一定的pH範圍中，通過改變酸和鹼的相對濃度可以使pH分布逐漸平緩。在製備本發明的溶液時，各個化合物的加入順序一般是不重要的。
權利要求
1.用於分析電泳和製備電泳的介質，其包含具有不同pKs值的酸和鹼，其特徵在於，包含至少二種其pKs值在約3.0至12之間的酸和至少二種其pKs值在約1.5至11之間的鹼，其中相鄰酸的pKs-值的差值(ΔpKs)不大於1，優選是0.8至0.5，相鄰鹼的pKs-值的差值(ΔpKs)不大於1，優選是0.8至0.5。
2.權利要求1的介質，其特徵在於，其包含至少3種酸和3種鹼。
3.權利要求1或2的介質，其特徵在於，所述酸的相對和絕對濃度隨pKs-值的升高而連續升高，所述鹼的相對和絕對濃度隨pKs-值的升高而下降，其中在每種情況下，與最強酸和鹼的濃度相比，較弱酸和/或較弱鹼的濃度在pKs值有小差異即pKs＝1-3時升高1.5至3倍，而在pKs值的差異大即pKs＝3-8時，較弱酸和鹼的相對濃度升高至達4至8倍。
4.上述權利要求之一項的介質，其特徵在於，在電泳遷移之後每個相鄰pH值單元形成酸/鹼對，產生相應於相應酸和相應鹼的pKs值的算術平均值的pH值。
5.上述權利要求之一項的介質，其特徵在於，選擇各個酸和鹼的濃度以便在電泳遷移之後在平衡狀態下確定和保持足夠的緩衝能力。
6.上述權利要求之一項的介質，其特徵在於，為了調節窄的pH-間隔，提高酸和鹼的絕對濃度，並且如果需要通過其相應的選擇降低該酸和鹼的ΔpKs。
7.上述權利要求之一項的介質，其特徵在於，每種情況下使用的酸和鹼的分子量低於300道爾頓。
全文摘要
本發明涉及一種用於分析電泳和製備電泳的介質，其包含具有不同pK
文檔編號G01N27/447GK1462368SQ01816132
公開日2003年12月17日 申請日期2001年8月30日 優先權日2000年9月21日
發明者格哈德·韋伯 申請人:格哈德·韋伯