適配體磁富集和rca雙信號放大檢測腫瘤細胞方法及應用的製作方法

2023-06-01 15:14:56 2

適配體磁富集和rca雙信號放大檢測腫瘤細胞方法及應用的製作方法
【專利摘要】適配體磁富集和RCA雙信號放大檢測腫瘤細胞方法及應用。本發明公開了一種用於白血病細胞檢測的探針組及其應用。本發明所提供的用於白血病細胞檢測的探針組由如下a)和b)組成：a)磁珠捕獲探針；所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定於所述磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針為序列1所示的單鏈DNA分子；b)檢測探針或所述檢測探針的前體；所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標記的鎖式探針的核苷酸序列為序列3所示的單鏈DNA分子；所述檢測探針是由所述磷酸標記的鎖式探針環化後與所述靶序列結合而成。實驗證明，本發明實現了高特異性和高靈敏的檢測，能從200萬個正常人外周血細胞中檢測出100個白血病細胞，靈敏度達到兩萬分之一。
【專利說明】適配體磁富集和RCA雙信號放大檢測腫瘤細胞方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物材料的臨床醫學應用領域，涉及一種適配體磁富集和RCA雙信號 放大檢測腫瘤細胞方法及應用，特別涉及一種用於檢測白血病細胞的基於磁富集和RCA雙 信號放大的探針組及其應用。

【背景技術】
[0002] 白血病是一類造血幹細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分 化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，並浸潤其他組織和器官， 同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染髮熱以及肝、脾、淋巴結腫大和 骨骼疼痛。
[0003] 白血病是我國的高發腫瘤之一，其分型診斷需要聯合形態學、免疫表型、細胞遺傳 學和分子生物學等各種手段。由於細胞形態的多樣性，單純依靠形態學檢查很難準確分型； 也未發現白血病細胞特異性單克隆抗體，白血病作為一種高度異質性疾病，抗原表達有時 較紊亂，跨系列表達較為常見，部分白血病相關抗原在治療過程中或復發時會丟失或發生 系列轉換；利用細胞遺傳學（染色體核型和顯帶）與分子生物學的檢查方法，使診斷的客觀 性和準確率明顯提高，但只有40%的急性淋巴細胞白血病（ALL)有染色體的異常，而且各 種臨床亞型並沒有對應特異性染色體異常，另外、這些檢查耗時、成本高，使之普及性有一 定難度。


【發明內容】

[0004] 本發明的一個目的是提供一種用於白血病細胞檢測的探針組。
[0005] 本發明所提供的用於白血病細胞檢測的探針組，具體由如下（a)和（b)組成：
[0006] (a)磁珠捕獲探針；
[0007] 所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定於所述磁珠上的捕獲探針（適配體）組成；所述 捕獲探針為序列表中序列1所不的單鏈DNA分子；
[0008] (b)檢測探針或所述檢測探針的前體；
[0009] 所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列表 中序列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標記的鎖式探針的核苷酸序列為序列表中序列3 所不的單鏈DNA分子；
[0010] 所述檢測探針是由環化的所述磷酸標記的鎖式探針與所述靶序列結合而成。
[0011] 所述檢測探針具體可按照包括如下步驟的方法由所述檢測探針的前體製備得到 的：將所述靶序列和所述磷酸標記的鎖式探針按照摩爾比為1 : (2-4)(如1 :3)的比例混 合，95°C孵育 5-10min (如 IOmin)後，加入 DNA 連接酶 15-20°C (如 16°C)孵育 10_16h (如 12h)，得到所述檢測探針。
[0012] 更加具體的，在本發明的一個實施例中，所述檢測探針的製備方法如下：（1)將所 述靶序列和所述磷酸標記的鎖式探針均用結合緩衝液（溶劑為水，溶質及濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 ·6Η20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/ L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖4. 5g/L)配成5 μ M濃度，然後將所得靶序列溶液、磷酸標記的鎖式 探針溶液和無菌水按照體積比為1 :3 :6的比例混合，95°C加熱10分鐘，緩慢冷卻至25°C ; ⑵向步驟⑴的體系中加入E. coli DNA連接酶，至其終濃度為0.04υ/μ1，16?孵育12h。
[0013] 所述磁珠捕獲探針具體可按照包括如下步驟的方法製備得到：將經生物素標記的 所述捕獲探針與經鏈黴親和素標記的所述磁珠共同孵育，獲得所述磁珠捕獲探針。
[0014] 在本發明中，所述生物素具體標記於所述捕獲探針的3'端。
[0015] 所述方法中，進行所述孵育時，經生物素標記的所述捕獲探針與經鏈黴親和素標 記的所述磁珠的配比為75pmol :lmg。
[0016] 進一步，所述孵育具體為20-30°C (如25°C )80-150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育 10-30(如15min)。所述孵育的液體環境為結合緩衝液；所述結合緩衝液的溶劑為水，溶 質及濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 · 6H20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
[0017] 更加具體的，在本發明的一個實施例中，所述磁珠捕獲探針的製備方法包括如下 步驟：分別取濃度為500nM(以DNA計量）的經生物素標記的所述捕獲探針的溶液（溶劑 為所述結合緩衝液）和濃度為l〇mg/ml (以磁珠計量）的經鏈黴親和素標記的所述磁珠 溶液（溶劑為所述結合緩衝液），按照體積比3:2的配比混合，20-30°C (如25°C )80? 150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育10-30min(如15min)，即獲得所述磁珠捕獲探針。
[0018] 含有所述探針組的試劑盒也屬於本發明的保護範圍。
[0019] 所述試劑盒中還含有分子信標；所述分子信標為由一端帶有螢光基團，另一端帶 有淬滅基團，核苷酸序列為序列表中序列4所示單鏈DAN分子形成的頸環結構。
[0020] 在本發明中，所述分子信標的5'端標記有螢光基團FITC，3'端標記有淬滅基團 DABCYL。
[0021] 所述探針組，或所述試劑盒，在如下任一中的應用也屬於本發明的保護範圍：
[0022] (a)製備用於白血病細胞檢測的試劑盒；
[0023] (b)製備用於白血病病情監測的試劑盒。
[0024] 在本發明中，所述白血病細胞檢測為從待測者的外周全血、骨髓細胞、白細胞或淋 巴細胞中檢測白血病細胞。
[0025] 在所述應用中，進行所述白血病病情監測時，採用的待測樣本可為待測者的外周 全血、骨髓細胞、白細胞或淋巴細胞。
[0026] 所述待測者可為白血病患者、健康的正常人、或患有其他疾病（如地中海貧血、骨 髓異常增多症、或缺鐵性貧血）的非白血病患者。
[0027] 在本發明中，所述白血病具體為急性淋巴細胞白血病（ALL)，如急性T淋巴細胞白 血病（T-ALL)。
[0028] 前文所述檢測探針或所述檢測探針的前體也屬於本發明的保護範圍。
[0029] 本發明採用磁富集和滾環擴增（rolling circle amplification,RCA)雙重信號放 大方式形成了一種高特異性和高靈敏的腫瘤細胞檢測方法。磁珠捕獲探針能從大量對照細 胞中將微量的靶細胞富集，並從中分離出來，相對於離心分離技術，操作簡便，不易丟失細 胞，有效減少了因細胞丟失而造成的信號降低；本發明還對反應時間等進行了優化，整個實 驗是在優化範圍內最好的條件下進行的；為了提高適配體探針檢測的靈敏性，本發明將檢 測探針檢測信號經RCA信號放大。本發明還採用了分子信標做信號報告分子，該分子信標 的環狀部分能與RCA產物的重複序列完全互補。只有發生了 RCA反應，RCA的長鏈產物有部 分序列與分子信標雜交，使分子信標自身雜交打開，突光信號才能得以恢復。分子信標的使 用明顯降低了背景螢光，提高了檢測的靈敏度。另外，本發明在均相中進行，相比界面反應 來說，細胞與適配體之間有更多的接觸機會，保證了反應更加快速和完全。由於以上原因， 本發明實現了高特異性和高靈敏的檢測，能從200萬個正常人外周血細胞中檢測出100個 白血病細胞，靈敏度達到兩萬分之一。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針的RCA反應信號放大電泳檢測結果及螢光儀 檢測結果。A為電泳成像結果；B為螢光儀檢測結果。
[0031] 圖2為螢光顯微鏡觀察細胞上RCA擴增的情況。左側圖片為光學顯微鏡下觀察， 右側為螢光顯微鏡下觀察。A、B :為RCA反應後0分鐘；C、D :為RCA反應後10分鐘；E、F : 為RCA反應後30分鐘；G、H :為RCA反應後60分鐘；I、J :為RCA反應後90分鐘；K、L為RCA 反應後120分鐘。
[0032] 圖3為流式細胞所檢測細胞上RCA擴增的情況。A為流式細胞儀檢測CEM細胞上 RCA擴增效果；為流式細胞儀檢測Ramos細胞上適配體RCA擴增效果；C為CEM和Ramos幾 何平均螢光強度比較柱狀圖。
[0033] 圖4為FITC標記的捕獲探針與聯合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測CEM細胞RCA 信號放大效果比較圖。
[0034] 圖5為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細胞特異性的捕獲圖。A為空白磁珠； B為捕獲探針對Ramos細胞的捕獲；C為捕獲探針對293-T細胞的捕獲；D為捕獲探針對CEM 細胞的捕獲。
[0035] 圖6為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細胞特異性檢測螢光顯微鏡結果圖。 左側圖片為明場圖，右側圖片為螢光成像圖。A、B為空白磁珠；C、D為Ramos細胞；E、F為 293T細胞；G、H為CEM細胞。
[0036] 圖7為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細胞特異性檢測螢光光譜圖。
[0037] 圖8為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細胞系與T-ALL患者淋巴細胞捕獲結 果比較顯微鏡成像圖。A為CEM細胞系捕獲前；B為CEM細胞系捕獲後；C為T-ALL患者外 周血淋巴細胞捕獲前；D為T-ALL患者外周血淋巴細胞捕獲後。
[0038] 圖9為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測白血病微殘留小病變結果（RQ-PCR儀檢 測結果）。圖中，線條1表示〇個CEM細胞；線條2表示50個CEM細胞；線條3-6分別表示 100、500、1000、2000 個 CEM 細胞。
[0039] 圖10為聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者外周全血細胞的檢測結果。A 為外周全血檢測結果螢光光譜圖；B為健康正常人與ALL患者外周全血檢測結果差異性比 較圖。
[0040] 圖11為ALL患者治療前後不同時間點外周血檢測結果（RQ-PCR儀檢測結果）。

【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0043] CEM細胞（人T淋巴細胞白血病細胞）：購自上海豐壽生物科技有限公司，貨號： Cell-3720。
[0044] Ramos細胞（人B淋巴瘤細胞）：購自上海拜力生物科技有限公司，貨號：RAM0S。
[0045] 293T細胞（Sv40轉化的人胚腎上皮細胞）：購自上海拜力生物科技有限公司，貨 號：293T。
[0046] 實施例1、用於白血病細胞檢測的探針組的製備
[0047] 一、磁珠捕獲探針的製備
[0048](一）經生物素標記的捕獲探針的製備
[0049] 所述生物素標記的捕獲探針為生物素標記的單鏈DNA分子，為中國大連寶生物公 司產品，該探針所用的單鏈DNA序列如下所示：
[0050] 5 ' -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAA-3 '（序列 1)，其中生物 素標記分子在核酸鏈的3'端。
[0051] (二）經鏈黴親和素標記的磁珠
[0052] 所述鏈黴親和素標記的磁珠為Invitrogen公司生產的Dynabeads鏈黴親和素磁 珠 Μ280,該磁珠的具體參數如下：如磁珠平均直徑2. 8μπι、表面積：4-8m2/g、密度：1. 4g/ cm3、磁珠含量：10mg/ml、等電點：pH 5.0、低電荷：-10mV(pH 7)、CV值〈3%、鐵含量（鐵氧 體）：12% (17% )。
[0053] (三）磁珠捕獲探針的製備
[0054] 1、將步驟（一）中獲得的經生物素標記的捕獲探針用結合緩衝液配製成濃度為 500nM(以DNA計量）的溶液。其中，結合緩衝液的組成如下（以IL溶液為例）：NaCl 8g， KCl 0· 2g，CaCl2O. 14g，Na2HPO4 · H2O 0· lg，MgCl2 · 6H20 I. 42g，NaHCO3O. 35g，KH2PO4O. 2g，葡 萄糖4. 5g;餘量為水。
[0055] 2、取200 μ I步驟（二）獲得的經鏈黴親和素標記的磁珠（濃度為10mg/ml，以磁 珠的量計算），用結合緩衝液（配方同上）洗滌2次後，再將磁珠懸浮於200 μ 1的結合緩衝 液中。
[0056] 3、取300 μ 1步驟1獲得的濃度為500ηΜ(以DNA計量）的經生物素標記的捕獲探 針溶液與200 μ 1經步驟2處理的鏈黴親和素標記的磁珠充分混勻後，於25°C IOOrpm震蕩 孵育15分鐘，置磁力架上，磁分離後，棄上清，所得沉澱用結合緩衝液（配方同上）重懸。
[0057] 4、用50 μ 1的結合緩衝液（配方同上）清洗兩次，最後用200 μ 1結合緩衝液（配 方同上）重懸已固定有DNA的磁珠至10mg/ml (以磁珠計）。
[0058] 二、檢測探針的製備
[0059] 1、設計併合成靶序列和磷酸標記的鎖式探針
[0060] 靶序列為：
[0061] 5 J -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAA TGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC- 3'（序列 2);
[0062] 磷酸標記的鎖式探針為（5' -3'）：
[0063] P03-TAGCACGGACATATATGATGGTACCGCAGACTAAGCCACCGTGATCACT ACTAAGTGGAAGAAA TGTAACTGTTTCCTTC (序列 3)。
[0064] 2、靶序列和磷酸標記的鎖式探針均用結合緩衝液（配方同上）配成5μΜ濃度，將 靶序列溶液、磷酸標記的鎖式探針溶液和無菌水按照體積比為1 :3 :6的比例混合，95°C加 熱10分鐘，緩慢冷卻至25°C。此步驟的目的是讓靶序列和鎖式探針結合。
[0065] 3、向步驟2的體系（20μ1)中加入4.5μ1大腸桿菌連接酶反應溶液（含 IOXligase Buffer 2μ1，10XBSA 2μ1，Ε· coli DNA 連接酶 0·5μ1(濃度為 2U/μ 1)， 16°C過夜孵育（12h)。此步驟的目的是讓鎖式探針連接成環。
[0066] 實施例2、用於白血病細胞檢測的探針組的應用實例
[0067] -、細胞的捕獲和突光信號的檢測
[0068] I、RCA反應隨反應時間信號放大情況檢測
[0069] A.待檢細胞：CEM細胞（人T淋巴細胞白血病細胞）。
[0070] (1)取4μ 1濃度為10mg/ml (以磁珠計）的實施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探針 和4μ 1濃度為500nM(以DNA計量）的實施例1步驟二獲得的檢測探針混勻，加入待檢細 胞25 °C孵育25分鐘。
[0071] (2)用結合緩衝液（配方同上）洗滌2次，將細胞懸浮於30. 1μ 1的結合緩衝 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信標 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應30min後進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及突光儀檢測，反應的第 Omin、10min、30min、60min、90min和120min分別進行突光顯微鏡觀察。
[0072] 其中，分子信標的核苷酸序列為：5' -TC TAC GG CAC TAC TAA GTG GAA GCC GTA GA-3'（序列 4)。
[0073] 分子信標的5'端標記有螢光基團FITC，3'端標記有淬滅基團DABCYL。
[0074] 瓊脂糖凝膠電泳檢測及螢光儀的檢測結果如圖1所示，圖1中的A可以看到在瓊 脂糖凝膠的出孔處可見明亮的條帶，表明形成了分子量很大的RCA產物；圖1中的B可以看 到RCA產物和分子信標雜交後可產生大量的突光信號。
[0075] 螢光顯微鏡觀察結果如圖2所示，可以看到，細胞上螢光強度隨著滾環放大反應 時間的增加而增強，表明聯合磁珠捕獲探針和檢測探針可以在細胞上進行RCA擴增，且隨 著時間的延長，產物逐漸增多。當滾環放大反應時間維持60分鐘左右時，可以觀察到細胞 螢光，120分鐘時螢光最強。
[0076] B.待檢細胞：CEM細胞（人T淋巴細胞白血病細胞）和Ramos細胞（人B淋巴瘤 細胞）。
[0077] (1)參照A中⑴進行。
[0078] (2)參照 A 中（2)進行，反應的第 Omin、10min、30min、60min、90min 和 120min 分別 採用流式細胞儀對螢光信號進行檢測。
[0079] 實驗同時設置採用FITC標記的捕獲探針（FITC-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATA CTGTACGGTTAGAAAAAA)替代探針組和分子信標的對照。具體如下：取4μ 1濃度為500nM(以 DNA計量）的FITC標記的捕獲探針，加入待檢細胞25°C孵育25分鐘。用結合緩衝液（配 方同上）洗滌2次，將細胞懸浮於32. 1μ 1的結合緩衝液（配方同上）中，加入7· 9μ 1 Phi29DNA 聚合混合反應液（10XPhi 29DNA polymerase Buffer 4μ I ;100XBSA 0·4μ I ; 2. 5mM dNTP 3μ I ;Phi29DNA polymerase 0· 5μ I)，30°C 反應 I. 5 小時後採用流式細胞儀對 螢光信號進行檢測。
[0080] 實驗同時設置以空白磁珠替代磁珠捕獲探針的空白對照。
[0081] 實驗組中，CEM細胞和Ramos細胞隨著反應時間的進行，流式細胞所檢測到的螢光 信號具體如圖3所示。可以看到隨著時間的延長，CEM細胞螢光強度逐漸增強（圖3中A)， 而Ramos細胞螢光強度變化不大（圖3中B);隨著時間延長，實驗組CEM細胞FITC-A Gea Mean成倍增加，RCA擴增120分鐘時，幾何平均螢光強度增至空白對照的近40倍，對照組 Ramos細胞無明顯增加（圖3中C)。以上結果表明CEM細胞的螢光強度明顯強於Ramos細 胞，聯合磁珠捕獲探針和檢測探針能有效的用於靶細胞的特異性檢測。
[0082] 另外，與FITC標記的捕獲探針和CEM細胞結合相比，捕獲探針經滾環擴增1. 5小 時後的樣品（即本發明探針組處理樣品）曲線明顯右移（圖4)。表明聯合磁珠捕獲探針和 檢測探針檢測信號經RCA後信號明顯放大。
[0083] 2、聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對捕獲白血病細胞的特異性分析
[0084] 待檢細胞：CEM細胞（人T淋巴細胞白血病細胞）、Ramos細胞（人B淋巴瘤細胞） 和293T細胞（Sv40轉化的人胚腎上皮細胞）。
[0085] (1)參照步驟IA中（1)進行。
[0086] (2)參照步驟IA中（2)進行，反應25min後採用光鏡和螢光顯微鏡對各細胞的捕 獲情況進行觀察，並採用螢光儀對各組的螢光信號強度進行檢測。
[0087] 實驗同時設置以空白磁珠替代磁珠捕獲探針的對照。
[0088] 光鏡觀察結果如圖5所示，可以看到CEM細胞周圍可見磁珠，而其他的細胞未被捕 獲或者細胞周圍未見磁珠，表明捕獲探針只捕獲CEM細胞。
[0089] 螢光顯微鏡觀察結果如圖6所示，可以看到，空白磁珠、Ramos和293T細胞樣品均 未見明顯螢光，而CEM細胞樣品中可見磁珠及細胞均有螢光信號。表明聯合磁珠捕獲探針 和檢測探針可以實現CEM細胞特異性檢測。
[0090] 螢光光譜圖如圖7所示，可以看到，CEM細胞樣品的螢光信號明顯強於293T細胞 和Ramos細胞。表明聯合磁珠捕獲探針和檢測探針可以實現CEM細胞特異性檢測。
[0091] 二、聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者淋巴細胞的檢測
[0092] 待測樣本：取自臨床確認為健康正常人的外周全血，以及取自臨床確診為T-ALL 患者的外周全血。
[0093] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然後按照如下步驟進行操作：
[0094] (1)淋巴細胞的獲取：用pH 7. 2的PBS將Iml的抗凝血按照體積比1 :1進行稀 釋；吸取Iml淋巴細胞分離液（Solarbio公司產品，其產品目錄號為P8610)置於刻度離心 管中。將稀釋的全血沿管壁緩慢加至淋巴細胞分離液上面；在18°C?20°C下，用水平離心 機以2000r/min離心20min，收集PBMC，用PBS液洗滌細胞3次，每次1600rpm，離心10分 鍾。用結合緩衝液（配方同上）重懸細胞，混勻，計數後加入完全1640培養基，移至6孔培 養板中培養30?45min，收集懸浮細胞即為淋巴細胞。
[0095] (2)分別取IX IO6淋巴細胞，置於96孔板中。
[0096] (3)取4 μ 1濃度為lOmg/ml (以磁珠計）的實施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探針 和4μ 1濃度為500nM(以DNA計量）的實施例1步驟二獲得的檢測探針混勻，加入待檢細 胞25 °C孵育25分鐘。
[0097] (4)用結合緩衝液（配方同上）洗滌2次，將細胞懸浮於30. 1μ 1的結合緩衝 液（配方同上）中，加入9.9ylPhi29DNA聚合混合反應液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信標 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應120min，然後用突光顯微鏡進行觀察。
[0098] 實驗同時設置以GEM細胞替代白血病患者淋巴細胞的對照。
[0099] 結果如圖8所示，可以看到，聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對GEM細胞和白血病患 者淋巴細胞的捕獲相似。表明可以利用CEM細胞建立微小殘留病變模型。
[0100] 三、微小殘留病變模型的建立和微小病變的檢測
[0101] 1、微小殘留病變模型的建立
[0102] 將50、100、500、1000、2000個CEM細胞分別與臨床確認為健康正常人的淋巴細胞 混合建立微小病變模型，使細胞總數達200萬個，得到微小殘留病變模型。
[0103] 2、微小病變的檢測
[0104] 待檢細胞：微小殘留病變模型細胞。
[0105] (1)參照步驟一 IA中（1)進行。
[0106] ⑵參照步驟一 IA中⑵進行，反應25min後，採用RQ-PCR儀對各組的螢光信號 強度進行檢測。
[0107] 實驗同時設置添加了 0個CEM細胞（即200萬個細胞均為健康正常人的淋巴細 胞）的正常人組。
[0108] 結果如圖9所示，可見100個CEM細胞以上的微小殘留病變模型的螢光強度均明 顯高於正常人對照，檢測靈敏度達2X10'實驗重複三次得到同樣的結果。
[0109] 四、聯合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者外周全血細胞的檢測
[0110] 待測樣本：取自臨床確認為健康正常人的外周全血，以及取自臨床確診為T-ALL 患者的外周全血。
[0111] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然後按照如下步驟進行操作：
[0112] (1)分別取健康正常人和T-ALL患者經過抗凝處理的外周全血100 μ 1，IOOOrpm離 心5分鐘，棄上清，從離心管底部吸棄大部分的紅細胞，加入2ml的結合緩衝液中（配方同 上）洗滌3次，最終將細胞懸浮於100 μ 1的結合緩衝液中（配方同上），待用。
[0113] (2)取4μ 1濃度為10mg/ml (以磁珠計）的實施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探 針，加入到20 μ 1步驟（1)最終獲得的細胞懸浮液中，25°C孵育25分鐘。緩慢加入100? 200 μ 1的結合緩衝液（配方同上）洗滌2-3次，加入2 μ 1濃度為500nM (以DNA計量）的 實施例1步驟二獲得的檢測探針，25 °C孵育25分鐘。
[0114] (3)用結合緩衝液（配方同上）洗滌2次，將細胞懸浮於30. 1μ 1的結合緩衝 液（配方同上）中加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信標 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應2小時後採用突光儀對各組的突光信號進行檢測。
[0115] 結果如圖10所示，可以看到，經聯合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測，ALL患者全血 的螢光強度明顯較正常人增強（圖10中A)，且差異有統計學意義，P < 0. 01 (圖10中B)。 表明聯合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測技術可以特異性檢測白血病細胞。
[0116] 五、聯合磁珠捕獲探針和檢測探針用於白血病病情監測
[0117] 待測樣本：取自臨床確診為T-ALL患者化療前、化療開始3天、4天和第13天的外 周全血。
[0118] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然後按照如下步驟進行操作：
[0119] (1)同步驟四（1)。
[0120] (2)同步驟四（2)。
[0121] (3)用結合緩衝液（配方同上）洗滌2次，將細胞懸浮於30. 1μ 1的結合緩衝 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信標 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5μ 1)，30°C反應2小時，採用RQ-PCR儀對各組的螢光信號強度進行檢測。
[0122] 結果如圖11所示，可以看到，隨著治療時間的延長，螢光信號逐漸減弱。表明本發 明的檢測技術可以用於白血病病情的動態監測。
【權利要求】
1. 一種用於白血病細胞檢測的探針組，由如下（a)和（b)組成： (a) 磁珠捕獲探針； 所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定於所述磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針為序列 表中序列1所不的單鏈DNA分子； (b) 檢測探針或所述檢測探針的前體； 所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列表中序 列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標記的鎖式探針的核苷酸序列為序列表中序列3所示 的單鏈DNA分子； 所述檢測探針是由環化的所述磷酸標記的鎖式探針與所述靶序列結合而成。
2. 根據權利要求1所述的探針組，其特徵在於：所述檢測探針是按照包括如下步驟的 方法由所述檢測探針的前體製備得到的：將所述靶序列和所述磷酸標記的鎖式探針按照摩 爾比為1 :(2-4)的比例混合，95°C孵育5-10min後，加入DNA連接酶15-20°C孵育10_16h， 得到所述檢測探針。
3. 根據權利要求1或2所述的探針組，其特徵在於：所述磁珠捕獲探針按照包括如下 步驟的方法製備得到：將經生物素標記的所述捕獲探針與經鏈黴親和素標記的所述磁珠共 同孵育，獲得所述磁珠捕獲探針。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的探針組，其特徵在於：進行所述孵育時，經生物素標 記的所述捕獲探針與經鏈黴親和素標記的所述磁珠的配比具體為75pmol :lmg ; 所述孵育具體為20-30°C 80-150rpm震蕩孵育10-30min ; 所述孵育的液體環境具體為結合緩衝液；所述結合緩衝液的溶劑為水，溶質及濃度 如下：NaC18g/L，KC10. 2g/L，CaCl20. 14g/L，Na2HP04 ? H200. lg/L，MgCl2 ? 6H201. 42g/L， NaHC030 . 35g/L，KH2P040. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
5. 含有權利要求1-4中任一所述的探針組的試劑盒。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於：所述試劑盒中還含有分子信標； 所述分子信標為由一端帶有螢光基團，另一端帶有淬滅基團，核苷酸序列為序列表中 序列4所示單鏈DAN分子形成的頸環結構。
7. 權利要求1-4中任一所述的探針組，或權利要求5或6所述的試劑盒，在如下任一中 的應用： (a) 製備用於白血病細胞檢測的試劑盒； (b) 製備用於白血病病情監測的試劑盒。
8. 根據權利要求1-8中任一所述的探針組或試劑盒或應用，其特徵在於：所述白血病 細胞檢測為從待測者的外周全血、骨髓細胞、白細胞或淋巴細胞中檢測白血病細胞。
9. 根據權利要求7所述的應用，其特徵在於：進行所述白血病病情監測時，採用的待測 樣本為待測者的外周全血、骨髓細胞、白細胞或淋巴細胞。
10. 權利要求1中所述的檢測探針或所述檢測探針的前體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388549SQ201410605342
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】趙永祥, 李霞, 盧小玲, 黃勇 申請人:廣西醫科大學