一種採用微板和枯草芽孢桿菌檢測抗生素殘留的方法

2023-06-02 01:53:41

專利名稱：一種採用微板和枯草芽孢桿菌檢測抗生素殘留的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於動物源食品，特別是鮮奶中抗生素殘留檢測的方法。
背景技術：
20世紀50年代人們發現將青黴素髮酵殘渣加入飼料中餵養動物能大幅度提高畜禽的生長速度以來，抗生素對於動物的促生長作用和它帶來的經濟效益得到了充分的證實，如今抗菌藥物已成為畜牧業的必需品。歐美等發達國家都在使用抗生素添加劑，許多發達國家80%的畜產品都是用含抗生素添加劑的飼料生產出來的。由於抗生素添加劑具有節約營養、保持健康、提高生產性能等作用，因此，抗生素添加劑在推動近代畜牧，尤其是集約化畜牧業的發展起了十分重要的作用，對亞洲等發展中國家或地區更是如此。可以這樣說，如果沒有抗生素及合成抗菌藥物，大多數亞洲國家的畜牧業就不會獲得今天這麼大的成就。但抗生素的使用同時也帶來了一系列的問題，人們越來越關注農產品中抗生素對人體健康的不良影響，國際農產品貿易中常因抗生素殘留問題引起國際貿易摩擦。隨著我國全面建設小康社會步伐的不斷推進，人民的生活水平的不斷提高，人們對農產品安全問題也越來越得到重視。農產品中抗生素、激素殘留汙染問題已受到社會的廣泛重視，農產品安全已成為當今影響廣泛而深遠的社會問題。抗生素殘留對人體具有一定的，有時甚至是嚴重的毒副作用，如對鏈黴素過敏的機體，即使攝取了含極少量的鏈黴素的食物，都會導致過敏反應的發生，如果經常食用含低劑量鏈黴素的產品會使原來對鏈黴素不起過敏反應的個體致敏。發生過敏的機體會出現肌肉震顫、站立不穩、心跳加速、呼吸減弱等症狀。嚴重者可引起休克、短時間內出現血壓下降、皮疹、喉水腫、呼吸困難等嚴重症狀，甚至危及生命。據統計，我國每年就有20萬人死於藥品不良反應，其中有40%也就是說有8萬人死於抗生素的濫用。目前，我國畜產品總量已經達到了相當大的規模，全國肉類產量已佔世界肉類總產量的1/4以上，但是我國肉類產品的出口量卻很少，僅佔左右，成了典型的生產的「巨人」，出口的「矮子」。我國畜產品出口不暢的原因主要是我國畜產品存在藥物殘留嚴重，品質不優，達不到進口國家的要求。這是我國畜產品在歐美市場屢屢愛阻的主要原因。細菌物在反覆接觸某一抗生素後，植物體內的敏感菌株可能會受到選擇性抑制， 而使耐藥菌株大量繁殖。人在經常食用含抗生素殘留的農產品後，植物體內的耐藥菌株可通過農產品傳播給人體。日本、美國、德國、法國和比利時學者研究證明，在乳、肉和動物臟器中都存在耐藥菌株，當這些食品被人食用後，耐藥菌株就可能進入到人的消化道內，當人體發生疾病時，再用同種抗生素治療很難奏效，給臨床上的治療帶來一定的困難。近年來隨著動物疫病、農作物病害的不斷增加和抗性不斷增強，抗生素的使用亦日趨泛濫，使其在動物性食品、農產品中過量殘留已成為危害人類身體健康的公共衛生問題，並嚴重影響到貿易出口，從而受到國內外的普遍關注。因此，如何對動物性食品、農產品中殘留的抗生素進行特異、靈敏、快速的檢測已成為一個研究熱點。澳大利亞、加拿大、丹麥、德國、波蘭、瑞士、英國、美國、菲律賓、日本等國家和我國港、臺地區均開展了抗生素藥物殘留檢測研究工作，並制定了相應的檢測方法及殘留限量。我國政府也高度重視這方面的工作，並相繼立項對殘留在食品中的多中抗生素進行分檢測研究。抗生素檢測總體上可以分為三大類理化分析法(波譜法、色譜及聯用技術)、免疫法(放射免疫法、螢光免疫法、酶聯免疫法)以及生物測定法(微生物測定法、放射受體測定法)。理化分析法是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量， 該方法對抗生素進行定性、定量測量，靈敏度高，但是一般需要昂貴的儀器設備、大量複雜的前處理、熟練的技術人員及較長的分析周期，而且只能用於單個樣本的檢測，因而不常用。免疫分析法是近年來發展起來的檢測動物源食品中抗生素殘留的方法，這種方法具有操作簡單、前處理簡化、分析成本低、靈敏度高、特異性強、檢測快速、不需要昂貴的儀器等優點。而且還可以同時測定幾個樣品，但此方法不可避免地也存在著一些缺陷，對試劑的選擇性高。很難同時分析多種成分，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應，分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。微生物檢測法根據抗生素對微生物的抑制作用來定性或者定量確定樣品中抗生素的殘留。這類方法可靠性高、操作簡單、費用低，反應靈敏，只需要幾個小時的培養就能觀察到結果，還有特異性的特點，如蠟狀芽孢桿菌對四環素類敏感，枯草芽孢桿菌對氨基糖苷類敏感。此外，一些微生物有特定的用處，如嗜熱脂肪芽孢桿菌對多種抗生素敏感、生長速度快、培養溫度高，對其他菌汙染少等特點。微生物法為目前抗生素檢測最常用的方法，目前該方法比較成熟的有牛津杯，但是牛津杯法工作量較大，反應時間較長，要左右，一個培養皿只能檢測一個樣品等缺點，目前比較新穎的微生物檢測方法為微板法，該方法方便快捷，工作量小，反應快速，只需要培養池左右就有顏色變化，此外一個板可以檢測多個樣品，對多個樣品檢測時優勢較大。

發明內容
本發明要解決的技術問題是建立一種簡單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應用的抗生素殘留微生物檢測方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是⑴菌種活化準備牛肉膏蛋白腖培養基備用，在無菌條件下，挑取一環枯草芽孢桿菌用劃線法接種至牛肉膏蛋白腖斜面，放入的恆溫培養箱中培養Mh。本次試驗復甦後的菌種在 1-2天後使用。(2)搖菌及轉接根據測試搖床中枯草芽孢桿菌懸液的OD值來確定最佳搖菌時間，以便在最佳時刻進行轉接培養及檢測。當OD值為0. 2時，菌的生長最旺盛，適合轉接培養檢測。在無菌操作臺上將枯草芽孢桿菌接到盛有75mL普通液體培養基的錐形瓶中，封口，即刻放入搖床，在，150r/min的條件下搖勻，適時測試其OD值，當OD值為0. 2左右時(該實驗大致為8小時)，將菌懸液從搖床中取出，等待轉接。(3)製備混合菌液搖菌時間滿後，取出菌液瓶，在無菌操作臺上，用移液槍取擴增好(待轉接)的菌液5mL(取前要充分搖勻)加入至IOOOmL培養基中混勻，該培養基含有葡萄糖1%，酵母粉 0. 2 %，牛肉膏0. 5 %，溴甲酚紫指示劑0. 00005 %。(4)微板的製作用移液槍取以上混合菌液270μ L，加入微板孔中，同時以未加菌液的培養基做無菌空白對照，在檢測樣品微板孔內再加入加30 μ L牛奶樣品或其它動物源食品的提取液。(5)檢測將所製得的檢測微板放入恆溫培養箱中培養4h後觀察結果。微板孔內培養基顏色變黃說明樣品中不含有抗生素或是抗生素的含量低於方法的檢出限。微板孔內培養基的顏色如果仍為紫色，說明樣品中有抗生素殘留。方法的檢測限(ppb)新黴素500鏈黴素3000慶大黴素300二雙氫鏈黴素3000卡那黴素5000氯黴素5000青黴素G5阿莫西林5應用實例一在超淨工作檯中挑取前一天培養的枯草芽孢桿菌單菌落，放入液體培養基中，放入搖床，55°C下震蕩培養7h，測0D600的範圍為0. 2-0. 4間。在微板第1列只加入270 μ L培養基，在2 12例之間加入的是270 μ L檢測培養基和菌懸液的混合溶液(其中檢測培養基87. 5 %，菌懸液12. 5 % )，然後在第1，3 6列上繼續加入30 μ L牛奶樣品，在第2列上加入無菌水，在7 12加入牛奶和抗生素的混合物， 其中A D加入的是青黴素和牛奶的混合物，7 12例濃度依次為10 10_5μ g/mL，E H加入的是氯黴素和牛奶的混合物，7 12濃度依次為1 10_5μ g/mL。在恆溫培養箱中培養池觀察，加入青黴素樣品中變色的最低濃度為0. 001 μ g/mL，加入氯黴素樣品變色的最低濃度為1 μ g/mL，這剛好符合國家對這兩種抗生素的安全標準。所有未添加抗生素的牛奶樣品的培養基均變成黃色，說明現在市售牛奶都是無抗奶。應用實例二在超淨工作檯中挑取前一天培養的枯草芽孢桿菌單菌落，放入液體培養基中，放入搖床，28°C下震蕩培養訃，測0D600的範圍為0. 2-0. 4間。在微板第1列只加入270 μ L培養基，在2 12之間加入的是270 μ L檢測培養基和菌懸液的混合溶液(其中檢測培養基87. 5%，菌懸液12. 5% )，然後在第1列的A D繼續加入30 μ L飼料雞蛋稀釋20倍的蛋清，第1列的E H加入土雞蛋稀釋20倍的蛋清，在第2列上加入無菌水，在3 12例A D加入飼料雞蛋稀釋20倍的蛋清，在E H加入土雞蛋釋20倍的蛋清，在恆溫培養箱中培養池後觀察結果。土雞蛋的11個樣品中，有 1個樣品未變色，而飼料雞蛋11個樣品中有5個未變色，說明這些樣品有可能有抗生素的殘留，但需要採用色譜法進行進一步確認。
權利要求
1.一種用於用於動物源食品，特別是鮮奶中抗生素殘留檢測的微生物方法，其特徵在於檢測實驗在96孔微板上進行。
2.權利要求1中的微生物，其特徵在於採用採用嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)為供試菌。
3.權利要求1中的檢測方法其特徵在於以溴甲酚紫為變色指示劑。
全文摘要
本發明公開了一種在微板上採用微生物方法檢測抗生素殘留的方法。這種方法採用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為供試菌，在96孔微板上對動物源食品中的抗生素殘留進行檢測，以溴甲酚紫為指示劑，通過指示劑的變色確定是否有抗生素的殘留。這種方法可以用在實驗室內對動物源食品中的抗生素殘留進行粗篩。通過實驗表明，這種方法比傳統的平板微生物方法檢測效率高，節約成分，並成靈敏度高。該方法的主要步驟是採用牛肉膏、葡萄糖、酵母粉和溴甲酚紫指示劑加蒸餾水配製成檢測培養基並將pH調至7.5，加入含有以上菌種的菌懸液，加入待測樣品，在培養箱中培養4小時，觀察培養基顏色變化以判定樣品中是否含有抗生素。
文檔編號G01N21/78GK102410999SQ20101029056
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月19日 優先權日2010年9月19日
發明者劉興泉 申請人:浙江農林大學