一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體t305a及其應用的製作方法
2023-06-01 14:51:36
一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體t305a及其應用的製作方法
【專利摘要】一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，是利用現代分子酶工程技術對來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）的左聚糖蔗糖酶胺基酸序列進行分子改造，通過易錯PCR和活力篩選，獲得突變體T305A，將其基因插入pSE380構建重組載體，導入大腸桿菌宿主表達。該突變體酶與野生型酶相比，在以蔗糖為底物轉糖苷形成左聚糖反應中的底物濃度耐受性顯著提高，達到最高轉化率時的底物濃度由野生型酶的10%提高到突變體酶的25%，有利於提高批次產量和設備利用率，降低生產成本。
【專利說明】—種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體是一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應用。
【背景技術】
[0002]左聚糖(Levan)是一類主要來源於微生物、通常以β-(2，6)糖苷鍵連接而成高分子量果聚糖。左聚糖已經被證實具有多種生物學活性，在抗腫瘤，抗病毒，增強身體免疫等方面都有一定的效果。左聚糖還具有增強免疫應激，改善腸道失衡的功能，是一種重要的食品添加劑，可以用於益生元、膳食纖維、低熱食品、減肥產品、降脂產品生產，還可以作為乳化劑、保溼劑、凝膠劑等等使用。左聚糖在保溼性能上和目前化妝品行業需求大價格高昂的透明質酸具有同等效果，在化妝品行業的應用有極大潛力。目前國內的左聚糖市場主要由韓國進口產品壟斷。
[0003]左聚糖鹿糖酶(levansucrase)又稱為果糖基轉移酶(fructosyltransferase,FTF, FTase, sucrose: 2, 6-D-fructan-6-D-fructosy I transferase, Lis, EC2.4.1.10),是一類可以將蔗糖水解成果糖和葡萄糖，並且可以通過轉糖苷作用將蔗糖中的果糖基轉移形成果聚糖的酶。
[0004]目前國內外已有一些利用微生物發酵方式產生左聚糖的研究，但還未成熟地實現產業應用。而利用左聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產左聚糖的研究報導很少，將左聚糖蔗糖酶進行分子改造提高效能的研究也開展得很少。已經報導的左聚糖蔗糖酶普遍存在著反應最適溫度低、熱穩定性不佳、底物濃度耐受性低或底物轉化率低等問題，相當多已經報導的左聚糖蔗糖酶其蔗糖底物濃度超過10%則引起轉化率顯著下降，制約了生產應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應用，該突變體能夠使以蔗糖為底物轉糖苷形成左聚糖反應中的底物濃度耐受性顯著提高，由原酶的10%提高到突變體酶的25%，有利於提高批次產量和設備利用率。
[0006]本發明採用的技術方案是:一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，是利用現代酶工程技術將野生型基因上的第913個鹼基由A替換為G，實現將野生型左聚糖蔗糖酶第305位胺基酸從原來的THR替換為ALA，改造得到一個新的左聚糖蔗糖酶突變體T305A。由於在工程菌構建中酶切和連接反應的需要，突變體T305A比野生型多一個胺基酸殘基Val，位於起始密碼子之後，因此在突變體T305A的胺基酸序列中，其第306位胺基酸對應於野生型左聚糖蔗糖酶第305位。
[0007]一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突變體基因t305a，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A，由474個胺基酸組成，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所不。[0009]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A在以蔗糖為底物轉糖苷產生左聚糖(Levan)中的應用。
[0010]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A，在野生型酶第305位胺基酸殘基相同位點突變所得突變體在以蔗糖為底物轉糖苷產生左聚糖中的應用。
[0011] (I)左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a的獲得
[0012]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a是根據Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長序列設計兩端引物，其中上遊引物Fl含有Nco I酶切位點，下遊引物Rl含有Pst I酶切位點和6個組氨酸(His)標籤，
[0013]上遊引物Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGTTTGC
[0014]下遊引物Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT。
[0015]通過常規PCR擴增獲得枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因片段，連接到pSE380載體構建出重組質粒PSE-SS56A，經測序驗證該野生型左聚糖蔗糖酶胺基酸序列與已公布的NC_00964枯草芽孢桿菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因編碼的左聚糖蔗糖酶的胺基酸序列僅有第472位一個胺基酸殘基不同；再以重組質粒PSE-SS56A為模板，採用相同引物通過易錯PCR擴增產生突變基因，將易錯PCR產物連接到pSE380載體轉化到大腸桿菌，通過抗性平板篩選重組子和活性測定得到突變體酶。
[0016](2)重組質粒的構建與驗證
[0017]用限制性內切酶EcoR I對提取的重組質粒進行單酶切驗證，根據線性重組質粒的分子量初步判斷是否構建成功，並進一步將重組質粒進行DNA測序分析，得出連入外源片段的核酸序列，確定正確的轉化子。
[0018](3)基因工程菌株的構建:
[0019]採用CaCl2化學法將驗證正確的重組質粒轉化到E.coli XLlO-Gold感受態細胞，利用氨苄青黴素抗性平板初篩獲得重組子，將重組子經液體培養，收集培養細胞經超聲波破胞後，測定破胞的粗酶液酶活力進行復篩，選出活力有改變的工程菌。用IPTG誘導工程菌表達重組蛋白，通過鎳親和層析法純化目的蛋白，檢測純化後的酶蛋白活力。
[0020]本發明的突出的實質性特點和技術效果在於:
[0021]利用現代微生物生物技術和分子酶工程技術，獲得一個新的枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，其在第305位胺基酸由野生型酶的THR突變為ALA。該突變體酶與野生型酶相比，在以蔗糖為底物轉糖苷形成左聚糖反應中的底物濃度耐受性顯著提高，達到最高轉化率時的底物濃度由野生型酶的10%提高到突變體酶的25%，有利於提高批次產量和設備利用率，降低生產成本，更適合於工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為左聚糖蔗糖酶突變體基因PCR擴增電泳圖。
[0023]圖2為連接有左聚糖蔗糖酶突變體基因的PSE380重組質粒的單酶切驗證電泳圖。
[0024]圖3為經鎳親和層析純化後所得左聚糖蔗糖酶突變體T305A純化產物的蛋白質SDS-PAGE電泳圖。
[0025]圖4為左聚糖蔗糖酶野生型酶在不同底物濃度下將蔗糖轉化為左聚糖的相對產率和相對轉化率的變化。[0026]圖5為左聚糖蔗糖酶突變體T305A在不同底物濃度下將蔗糖轉化為左聚糖的相對產率和相對轉化率變化。
【具體實施方式】
[0027]本發明使用的枯草芽孢桿菌菌種可以從菌種保藏中心購買，也可以通過野外採集或者其他途徑獲得。微生物培養、基因克隆、表達技術和相關的技術方案是本領域中常用的成熟技術，涉及的專業術語也是本領域中常見的專業術語，實施例是說明性的，而不是限定性的，不能被解釋為限定本發明的保護範圍。
[0028]下面將通過實施例對本發明作詳細描述:
[0029](I)左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a的獲得
[0030]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) sp.56A是本實驗室從土壤中篩選所得,經過16S rRNA序列分析比對鑑定為枯草芽孢桿菌。通過提取枯草芽孢桿菌sp.56A的基因組DNA為模板，根據Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長序列設計兩端引物，其中上遊引物Fl含有Nco I酶切位點，下遊引物Rl含有Pst I酶切位點和6個組氨酸(His)標籤，通過常規PCR擴增枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因，將PCR產物用Nco I和Pst I雙酶切後連接到同樣雙酶切的PSE380載體，構建出攜帶有枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因的重組質粒pSE-SS56A，經測序驗證該野生型左聚糖蔗糖酶胺基酸序列與已公布的NC_00964枯草芽孢桿菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因編碼的左聚糖蔗糖酶胺基酸序列僅有第472位一個胺基酸殘基不同；再以重組質粒PSE-SS56A為模板，採用相同引物通過易錯PCR擴增產生突變基因，將易錯PCR產物連接到pSE380載體轉化到大腸桿菌，通過抗性平板篩選重組子和活性測定得到突變體酶。
[0031 ]上遊引物 Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC [0032]下遊引物Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT
[0033]常規PCR 擴增反應體系為:5XPrimer STAR PCR buffer5.0 μ L，2.5mmol/L 的dNTPs2.0yL, 50mmol/L 的上下遊引物各 1.0 μ L，DNA 模板 0.5 μ L, Primer STAR?0.5 μ L,加超純水至反應總體積為25 μ L
[0034]常規PCR擴增條件為:95°C解鏈3min，94°C變性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共進行30個循環反應；然後於72°C繼續延伸lOmin。
[0035]易錯PCR 擴增反應體系為:10XPCR bufferl0.Ομ L，25mmol/L 的MnCl22.0 μ L, 25mmol/L 的 MgCl222.0 μ L, 100mmol/L 的 dATP0.2 μ L, 100mmol/L 的dGTP0.2 μ L, IOOmmoI/L 的 dCTPl.0yL, IOOmmoI/L 的 dTTPl.0yL, 50mmol/L 的上下遊引物各2.0 μ L，DNA模板I μ L，Lc Taq3.0U,加超純水至反應總體積為100 μ L。
[0036]易錯PCR擴增條件為:95°C解鏈3min，94°C變性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共進行30個循環反應；然後於72°C繼續延伸lOmin。
[0037]將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測到擴增產物大小與目的基因片段大小基本吻合(圖1)。PCR產物用PCR產物純化試劑盒(天澤公司產品)進行純化，具體步驟參考試劑盒說明書。純化的PCR產物用限制性內切酶Nco I和Pst I雙酶切後連接到同樣雙酶切的PSE380載體，連接產物用CaCl2K學法轉化到大腸桿菌E.coli XLlO-Gold感受態細胞，通過氨苄青黴素抗性平板篩選挑取重組子。從挑取的重組子提取質粒，用EcoR I單酶切驗證，所得重組質粒分子量與攜帶有目的片段的PSE380載體理論分子量基本吻合(圖
2)，則可進一步進行DNA測序分析確定正確的轉化子。
[0038]用CaCl2K學法將驗證正確的重組質粒轉化到E.coli XLlO-Gold感受態細胞，構建基因工程菌。將構建好的基因工程菌接種於含100 μ g/mL氨苄青黴素的5mL液體LB培養基，37°C培養10h。取2.0mL的液體種子接種到含100 μ g/mL氨苄青黴素的200mL液體LB培養基，37°C培養2-3h，當0D_達到0.6~1.0之時，加入終濃度為0.5~1.0mmoI/L的IPTG，於20°C、200r/min轉速下進行誘導培養20h左右，收集細胞，採用超聲波破胞製備粗酶液，經過鎳親和層析純化，純化重組蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，得到比較明顯的單一條帶(圖3)，說明重組酶純化效果較好，可用於酶活力測試。
[0039]本發明採用提取稱重法測定左聚糖蔗糖酶以蔗糖為底物轉糖苷產生左聚糖的聚合酶活力。
[0040]酶活測定的步驟為:取適量的左聚糖蔗糖酶純化液，在適當PH緩衝體系中與蔗糖反應一定時間。反應結束後，在反應體系加入2-3倍無水乙醇，於4°C靜置過夜使多糖充分沉澱，同時使單糖儘量溶解在溶液裡。然後在4°C用13000g離心30分鐘，棄去上清，所得左聚糖沉澱在60°C真空烘乾至恆重，稱出左聚糖產物的重量，即可計算聚合酶活力。
[0041]野生型酶在蔗糖底物濃度為10%時達到最高的產物轉化率(圖4)，之後隨著底物濃度升高轉化率明顯逐步下降；而左聚糖蔗糖酶突變體酶T305A在蔗糖底物濃度為25%達到最高的產物轉化率(圖5)，之後才略有下滑。可見，僅僅在野生型酶第305位一個胺基酸殘基的改變對左聚糖蔗糖酶的底物濃度耐受性有顯著影響。
[0042]提高酶的底物濃度耐受性意味著可以在單個批次生產中投放更多的底物原料而不影響酶的產物轉化效率，提`高設備利用率，縮短生產周期，降低生產成本，更適合工業化生產應用。
[0043]應該理解的是，對本領域技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，例如，所述的野生型左聚糖蔗糖酶除了來源於枯草芽孢桿菌之外，還可以來源於地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、類芽孢桿菌等菌株。所述的載體適於在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、畢赤酵母等宿主中表達，也可通過電轉化法、原生質體轉化法等將本發明的左聚糖蔗糖酶突變體轉入原核或者真核宿主中，以實現左聚糖蔗糖酶突變體的表達。或者通過酶工程技術對同一位點的胺基酸殘基進行替換。而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突變體基因t305a，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據權利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據權利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a，其特徵在於，該突變體基因是根據Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長序列設計兩端引物，其中上遊引物Fl含有Nco I酶切位點，下遊引物Rl含有Pst I酶切位點和6個組氨酸(His)標籤， 上遊引物 Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC 下遊引物 Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGITTGTTAATTGTTAATT。
4.根據權利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A在以蔗糖為底物轉糖苷產生左聚糖Levan中的應用。
5.根據權利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質T305A，在野生型酶第305位胺基酸殘基相同 位點突變所得突變體在以蔗糖為底物轉糖苷產生左聚糖中的應用。
【文檔編號】C12P19/04GK103484482SQ201310403373
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】楊輝, 黃日波 申請人:廣西大學