一種釀酒酵母中Rav2p基因克隆與表達的方法

2023-06-03 19:25:06 1

專利名稱：一種釀酒酵母中Rav2p基因克隆與表達的方法
技術領域：
本發明涉及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav2p的基因克隆與表達， 屬於微生物基因工程領域。
背景技術：
V-ATP酶(Vacuolar ATPase)是一種普遍存在於真核生物的內膜系統和高級真核 生物特殊組織細胞的細胞質膜中靠水解ATP來轉移質子的多亞基蛋白質大分子。以酵母為例，這種酶由兩大結構功能部分共14種亞基組成。一部分是水溶性的 V1,由8種亞基組成，主要功能是水解ATP。另一部分是嵌於膜中的Vtl，由6種亞基組成，主 要功能是轉移質子。這兩大部分之間形成一種柄狀結構從而使得這兩部分從功能和結構上 成為一個整體(Biochim Biophys Acta 2008，1777 (7-8) :599-604)。目前研究發現生物體調節V-ATP酶活性的方式主要有三種，其中一種是V-ATP酶 V1和Vtl部分的可逆分解是調控自身酶活性的有效方式。這一調控方式可在能量較低的情 況下為胞內的基礎代謝保留ATP，是一種由於營養物質(葡萄糖)快耗盡時而產生的一種自 我保護機制(Mol Cell Biol 1998,18(12) :7064-7074)。在用高壓二氧化碳殺滅食品飲料 中酵母細胞的加工過程中，V-ATP酶對於維持酵母細胞的高壓二氧化碳耐受性起到了關鍵 作用(Int J FoodMicrobiol. 2005，105 :131-137)。RAVE(regulator of the H+-ATPase of vacuolar and endosomal membranes) 包含Skplp、Ravlp和Rav2p三個亞基，在V-ATP酶的上述活性調節方式中起很重要的作用 (Nat Cell Biol. 2001,3(4) :384-391.)。研究發現 RAVE 通過與 V-ATP 酶 V1 部分的 E 亞基 和 G 亞基作用從而調節 V-ATP 酶的活性(J Biol Chem 2002,277(16) 13831-13839)。

發明內容
本發明的目的是提供一種釀酒酵母Rav2p亞基的基因克隆與表達的方法。針對釀 酒酵母中RAVE複合物的Rav2p亞基的基因(縮寫為rav2)設計了引物1 5，CGCCATATGAGT GTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)和引物 2 5』 -GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3』 (Not I)，建立 了釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法、Rav2p基因原核表達載體構建的方法及Rav2p在大 腸桿菌中表達的方法。本發明的技術方案從NCBI上查找釀酒酵母中rav2的基因序列，利用DNAman等 軟體設計合適的引物克隆出rav2的基因序列。將PCR產物與T載體相連測序以驗證克隆 序列的正確性。雙酶切PCR產物然後與經同樣雙酶切的pET-21c相連。選擇正確的重組子 並將其轉入BL21(DE3)實現rav2的異源表達。本發明的有益效果本發明人的方法，採用菌落PCR的方法以釀酒酵母BY4742 的基因組DNA為模板克隆出rav2的全基因序列，並在基因兩端加入Not I和Nde I限 制性內切酶的識別位點，與經同樣內切酶消化的pET-21c表達質粒相連並轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)，實現了異源表達。
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利用本發明人構建的重組表達質粒可以實現Rav2p在釀酒酵母細胞內的基因刪 除，方便構建高壓二氧化碳低耐受性的酵母菌株，為食品飲料行業提供新型發酵菌株。
四

圖 1.質粒 PET-21C圖2.重組質粒pETR2圖3. Rav2p的誘導表達。M為Market，1為對照，2為ImM的IPTG誘導3h的全細 胞裂解物。圖4. SEQ ID NO :1，釀酒酵母中RAVE複合物的Rav2p亞基基因(縮寫為rav2)的 核苷酸序列圖5. SEQ ID NO :2，Rav2p 的胺基酸序列
五具體實施例方式實施例1 釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法將釀酒酵母BY4742接種於YEPD培養基平板上，30°C培養M小時左右待平板上長 出菌落時放4°C冰箱保存待用。從NCBI網站上查找rav2基因序列(如SEQ ID NO 1所示)，並設計引物引物 1. 5，CGCCATATGAGTGTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)引物 2. 5，-GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3，(Not I)
權利要求
1.一種釀酒酵母中Rav2p的基因的克隆方法。其特徵是(1)針對釀酒酵母中RAVE複合物的中Rav2p亞基的基因，設計了引物1:5，CGCCATATG AGTGTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)和引物 2 :5』 -GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3，(Not I)；(2)直接以釀酒酵母BY4742(該菌種在國內外已廣泛用於科研，且已有文獻報導)菌落 作為PCR反應模板。具體操作方法見實施例1。
2.如權利要求1所述Rav2p基因的重組原核質粒表達載體構建的方法(具體見實施例2)。
3.一種釀酒酵母Rav2p在大腸桿菌中表達的方法(具體操作見實施例幻，其特徵是以 權利要求2所述的質粒為表達載體，以大腸桿菌BL21(DE3)(該菌種在國內外已廣泛用於科 研，且已有文獻報導)為表達宿主，實現Rav2p的高效表達。
全文摘要
一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav2p基因克隆與表達的方法，屬於微生物基因工程領域。本發明設計了引物15』CGCCATATGAGTGTTGATTTGTTTCC-3』(Nde I)和引物25』-GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3』(Not I)，建立了釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法，建立了Rav2p基因原核表達載體構建的方法，建立了Rav2p在大腸桿菌中高效表達的方法。Rav2p為釀酒酵母中RAVE複合物的重要組成部分，利用本發明人構建的重組表達質粒可以實現Rav2p在釀酒酵母細胞內的基因刪除，方便構建高壓二氧化碳低耐受性的酵母菌株，為食品飲料行業提供新型發酵菌株。
文檔編號C12N15/70GK102071188SQ20101029788
公開日2011年5月25日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者張光明, 張峰, 張震宇 申請人:江南大學