鑑別肝素中牛基因來源的螢光pcr檢測試劑及製備方法和應用的製作方法
2023-06-03 06:29:46 1
鑑別肝素中牛基因來源的螢光pcr檢測試劑及製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑑別肝素中牛基因來源的螢光PCR檢測試劑及製備方法和應用，通過對牛基因的測序和比對，提供了用於檢測肝素粗成品中牛成分來源的檢測方法、實時螢光定量PCR引物和探針，對牛成分檢測的擴增目標片段長度為92bp，本發明還提供了對牛基因進行定量檢測的試劑盒。本發明的檢測方法及檢測試劑盒具有檢測準確、靈敏度高、特異性強等優點，具有良好的標本檢測能力。
【專利說明】鑑別肝素中牛基因來源的螢光PCR檢測試劑及製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種能鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，以及這種試劑的製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]肝素是一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，在體內外都有抗凝血作用。臨床上主要用於血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環、血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。
[0003]2010年我國肝素及其鹽的出口量創歷史新高，已躍居成為我國第一大西藥重點出口商品。2010年，我國肝素及其鹽共出口到51個國家和地區，出口集中度很高，前五大出口市場為法國、美國、德國、奧地利和義大利，所佔出口比重累計高達86.32%。肝素原料藥可直接被用於製成標準肝素製劑，或進一步加工製成低分子肝素原料藥再製成低分子肝素製劑。標準肝素製劑和低分子肝素製劑可直接應用於臨床治療。肝素類產品主要包括肝素粗品、肝素原料藥、標準肝素製劑、低分子肝素原料藥以及低分子肝素製劑。
[0004]由於肝素類藥物主要是運用於心腦血管疾病和血液透析治療，其中在血液透析重症治療中是唯一有效的特效藥物，其使用者集中於老齡和肥胖人群，主要消費市場分布集中在歐洲、美國和日本等發達國家。國際市場對肝素原料藥的需求十分強勁，主要是由於其下遊產品肝素類藥物市場迅速擴容，並保持高速增長趨勢。預計到2015年，全球肝素類藥品的市場規模將達到79億美元，這意味著全球醫藥市場對肝素的需求仍將強勁增長。但是2008年的「肝素鈉事件」發生後全球肝素類藥物企業高度關注肝素鈉原料藥的質量，對通過FDA和CEP認證的肝素鈉原料藥需求量大幅增加，而那些不具備這項質量認證的企業今後將無法立足國際市場。因此，對於肝素鈉的質量檢測成為了一個熱點問題，新版藥典中對於肝素鈉的來源檢測做出了明確規定，原因如下:
[0005]肝素首先從肝臟發現而得名，它也存在於肺、血管壁、腸黏膜等組織中，是動物體內一種天然抗凝血物質。天然存在於肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸黏膜提取。但是由於牛等反芻動物可能攜帶致病性朊蛋白，從而患傳染性海綿狀腦病(俗稱羊瘙癢病和狂牛症)。人類可能被攜帶病毒的動物傳染而患新型克雅氏症。由於牛海綿狀腦病以及其他動物病毒疾病的存在，豬來源的唯一性就成為了確保肝素安全性的一條關鍵要求。因此，為確保肝素供應鏈的安全，各國在肝素進口方面明確要求肝素原料藥不允許來自於牛，同時加大了對中國出口肝素產品的質量、來源等方面的質量要求和抽檢力度。故開發一種高效的檢測肝素來源的試劑及方法顯得尤為必要。
[0006]目前，粗品肝素中有害雜 質的檢測方法主要有核磁共振、高效液相色譜等方法。隨著分子生物學技術的迅猛發展，PCR技術得到了快速發展。由於肝素在製備的過程中需要經過多次提取與純化，當中的DNA會受到影響而降解為許多小片段，如果檢測目的片段太大，可能在檢測中無法發現陽性片段。而受電泳檢測有效性的限制，一般PCR難以採納小片段目的產物。中國專利申請號200810123709.5由黃亞紅、侯亞義等人公開了一種通過巢式PCR的方法鑑定肝素中動物基因的來源。但一般的PCR方法需要對PCR產物進行凝膠電泳完成整個檢測，而且通過電泳條帶進行檢測靈敏度偏低，當樣品中基因濃度差異不大時，條帶亮度很難反應出差異，進而影響對肝素中牛基因有無的判斷。而且凝膠電泳檢測會延長整個檢測時間，拖延檢測進度。因此，這種方法存在著檢測靈敏度低、操作複雜等問題。中國專利申請號200910094768.9公開的鑑別反芻動物源性成分的螢光PCR檢測試劑及製備方法和應用的發明專利中，涉及了一種能同時鑑別包含牛、山羊及綿羊三種反芻動物品種的生物檢測試劑，以及這種試劑的製備方法和應用。但此體系並不適用於肝素中牛基因的檢測，主要原因可以歸納為以下三點:1)經多人的研究結果表明，肝素多糖對於PCR擴增酶有抑制作用，不能直接用於real-time PCR實驗,必須經過一定的處理才可行；2)此專利中方法較為複雜，多重PCR不利於肝素中牛基因的檢測；3)此外這種方法的反應體系為50 μ 1，對試劑的消耗較大，大大提高了檢測成本，不利於實現企業規模化檢測。
【發明內容】
[0007]本發明提供了一種能鑑別檢測肝素粗製樣品的來源組成(牛基因)的螢光定量PCR檢測試劑，及其製備方法和應用。本發明利用TaqMan螢光定量PCR方法克服了普通PCR的不足之處，是檢測肝素原料藥中的反芻動物基因的最佳方法，具有靈敏度高、線性範圍廣、分析時間短、操作簡便、重複性好、結果直觀等特點。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0009]一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，包括一對引物和一條TaqMan探針，所述一對引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探針是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0010]進一步的，所述TaqMan探針SEQ ID N0.3的5』端連接有螢光報告基團，3』端連接
有淬滅集團。
[0011]進一步的，所述5』端連接的螢光報告集團為6-羧基螢光素(FAM)，所述3』端連接的淬滅集團為6-羧基四甲基諾丹明(TAMRA)。上述的FAM全稱為6_carboxy-f Iuorescein,是標記在探針5』端的6_羧基突光素；TAMRA的全稱為Carboxytetramethylrhodamine,是標記在探針3端的6-羧基四甲基諾丹明。
[0012]本發明的另一目的是通過以下技術方案實現的:
[0013]一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的製備方法，所述製備方法包括以下步驟:
[0014]I)選擇牛線粒體基因中特異和保守的BOV-A2基因的保守序列片段為靶目標，其基因片段的擴增目標核苷酸序列為SEQ ID N0.4；
[0015]2)根據牛特異和保守的線粒體基因保守序列的特點,應用Primer Express3.0軟體和DNAStar中的PrimerSelect軟體,設計合成待測引物和探針；
[0016]3)引物和探針的合成使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；
[0017]4)探針合成同時進行兩端標記，探針5』端標記的螢光報告基團是FAM (6_羧基螢光素)，3』端標記的基團是TAMRA (6-羧基四甲基諾丹明)；
[0018]5)將設計合成的引物和探針進行最佳配對篩選實驗後，得到上述的引物和探針。[0019]所述的鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的應用，所述一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑可用於製備螢光定量PCR標準化試劑盒。
[0020]本發明的另一目的是通過以下技術方案實現的:
[0021]一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟:
[0022]A.待檢測肝素的前處理
[0023](I)將粉末狀肝素樣品0.03g加至滅菌離心管中，向管中加入1ml無酶水，振蕩混勻，離心機3500rpm,30s, 100°C水浴5min,放冷至室溫；
[0024](2)槍頭反覆吸取攪拌至樣品溶解，從溶解的樣品溶液中取10 μ I至一新的滅菌離心管中，再加入990 μ I無酶水，振蕩混勻，用Iml注射器使溶液通過45 μ m微孔濾膜過濾；
[0025](3)從上一步得到的溶液中取45 μ I溶液，加入0.7μ I試劑肝素酶，振蕩混勻，28°C水浴18h，得到待測肝素樣品；
[0026]B.螢光定量PCR
[0027](I) PCR反應體系
[0028]突光定量PCR採用25 μ I體積反應液,反應擴增體系與擴增條件按下述反應參數進行:
[0029]實時螢光定量PCR反應總體積為25 μ I,向反應管中加入下列組分,反應體系為:
[0030]
【權利要求】
1.一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，包括一對引物和一條TaqMan探針，其特徵在於，所述一對引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探針是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1中所述的鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，其特徵在於，所述TaqMan探針SEQ ID N0.3的5』端連接有螢光報告基團，3』端連接有淬滅集團。
3.根據權利要求2中所述的鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，其特徵在於，所述5』端連接的螢光報告集團為6-羧基螢光素，所述3』端連接的淬滅集團為6-羧基四甲基諾丹明。
4.一種如權利要求1所述的鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的製備方法，所述製備方法包括以下步驟: 1)選擇牛線粒體基因中特異和保守的B0V-A2基因的保守序列片段為靶目標，其基因片段的擴增目標核苷酸序列為SEQ ID N0.4 ； 2)根據牛特異和保守的線粒體基因保守序列的特點，應用PrimerExpress3.0軟體和DNAStar中的PrimerSelect軟體,設計合成待測引物和探針； 3)引物和探針的合成使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成； 4)探針合成同時進行兩端標記，探針5』端標記的螢光報告基團是FAM(6-羧基螢光素)，3』端標記的淬滅基團是TAMRA (6-羧基四甲基諾丹明)； 5)將設計合成的引物和探針進行最佳配對篩選實驗後，得到上述的引物和探針。
5.一種如 權利要求1所述的鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的應用，所述一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑可用於製備螢光定量PCR標準化試劑盒。
6.一種鑑別肝素中牛基因來源的生物檢測方法，其特徵在於，所述檢測方法包括以下步驟: A.待檢測肝素的前處理 (1)將粉末狀肝素樣品0.03g加至滅菌離心管中，向管中加入1ml無酶水， 振蕩混勻，離心機3500rpm,30s, 100°C水浴5min,放冷至室溫； (2)槍頭反覆吸取攪拌至樣品溶解，從溶解的樣品溶液中取10μ I至一新的滅菌離心管中，再加入990 μ I無酶水，振蕩混勻，用Iml注射器使溶液通過45 μ m微孔濾膜過濾； (3)從上一步得到的溶液中取45μI溶液，加入0.7μ I試劑肝素酶，振蕩混勻，28°C水浴18h，得到待測肝素樣品； B.螢光定量PCR (I)PCR反應體系 螢光定量PCR採用25 μ I體積反應液，反應擴增體系與擴增條件按下述反應參數進行: 實時螢光定量PCR反應總體積為25 μ I,向反應管中加入下列組分,反應體系為:
Μ?Χ|12.5μ I
上遊引物F 0.5μ1
下遊引物R 0.5μ I
【文檔編號】C12Q1/68GK103937881SQ201410115327
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】李曄, 全爽, 金麗華 申請人:北京電子科技職業學院