一種葡萄球菌蛋白a及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-03 14:48:01 2

專利名稱：一種葡萄球菌蛋白a及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，涉及ー種葡萄球菌蛋白A及其製備方法和用途。
背景技術：
葡萄球菌蛋白AGtaphylococal Protein A, SPA)是ー種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有ー種物質，在雙向擴散試驗中，能與正常人血清形成沉澱。1959年，Jensen也發現了類似現象，將其命名為A抗原；1960年Grov將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA蛋白A，1963年Lofkvist等分離了 A抗原，並證明它是ー種蛋白質，且與糖有區別。葡萄球菌蛋白A是抗體純化的重要介質。隨著我國生物技術產業，特別是以單克隆抗體藥物為代表的生物製藥產業的快速發展，葡萄球菌蛋白A的市場需求將迅速増加。但在使用含有葡萄球菌蛋白A的親和層析技術吋，存在親和カ低、純化效率低等問題，因此在使用該親和層析技術時，需要一種改進的葡萄球菌蛋白A，來實現更高的親和力，提高純化的效果。

發明內容
本發明的目的之一在幹，提供ー種葡萄球菌蛋白A，以克服現有技術的不足。本發明的第二個目的在幹，提供編碼該葡萄球菌蛋白A的基因序列。本發明的第三個目的在幹，提供含有該葡萄球菌蛋白A基因的載體。本發明的第四個目的在幹，提供含有該葡萄球菌蛋白A基因的表達載體轉化宿主細胞。本發明的第六個目的在幹，提供該葡萄球菌蛋白A的用途。本發明的第七個目的在幹，提供一種由該葡萄球菌蛋白A和層析介質載體組成的親和層析介質。本發明提供的葡萄球菌蛋白A的胺基酸序列如SEQ ID NO :1、5、7或11所示。本發明提供的編碼如權利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列如SEQ ID NO :2、6、8 或 12 所示。本發明提供的重組表達載體含有本發明提供的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。本發明提供的宿主細胞由本發明提供的表達載體轉化，優選的，宿主細胞是大腸桿菌，更優選的，大腸桿菌是BL21 (DE3)。本發明提供的葡萄球菌蛋白A的用途為用於抗體檢測、分離、純化。本發明提供的親和層析介質由本發明提供的葡萄球菌蛋白A與層析介質載體組成，優選的層析介質載體是瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、矽膠或帶羥基的高分子聚合物。本發明的葡萄球菌蛋白A基因的表達產物葡萄球菌蛋白A可用幹與各種不同的層析介質載體如瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、帶羥基的高分子聚合物、矽膠等偶聯成為親和層析介質用於抗體的分離純化。使用本發明提供的葡萄球菌蛋白A製備的親和層析介質具有蛋白結合特異性強， 親和カ高，純化效率大大改善的優點，與市售的ftOteinA Sepharose 4Fast Flow相比，其動態吸附載量明顯提高。
具體實施例方式以下結合實施例進ー步說明本發明，下述實施例不應理解為對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法以及經典的細胞融合和單克隆抗體篩選及純化的方法等。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，Ε. F. and Maniais， Τ. (1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual,2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press.在本發明的下述實施例中，使用的
緩衝液A為pH7. 4的PBS溶液；緩衝液B為pH4. O的20mM檸檬酸緩衝液，其配製方法如下檸檬酸2. Ig加水 950ml，用 5M NaOH 調至 pH4. 0，加水至 IOOOml ；緩衝液C為pH3. O的0. 5M醋酸緩衝液，其配製方法如下0. 5M醋酸溶液用固體 NaOH 調至 pH3. 0。在本發明的下述實施例中，使用的人IgGl按中國發明專利01132225. X中公開的方法製備。實施例1、合成葡萄球菌蛋白A基因單體通過化學合成的方法，設計合成葡萄球菌蛋白A基因一個重複片段的序列，其序列包括長度為174bp，前端加入與表達載體相連的NcoI酶切位點，6個His (用於親和層折， 與鎳柱結合，減少純化步驟)、EK酶切位點(用於將His和DDDDK切去，形成正確的Protein Α)和AccI酶切位點(用於連入多個重複片段)。另外，還包括終止密碼子TAA，及克隆用 BamH I限制性內切酶接頭共9bp。通過化學合成的方法，設計合成葡萄球菌蛋白A基因一個重複片段的序列，其序列包括長度為174bp，兩端為AccI酶切位點，用於構建含有多個重複片段的序列。其中，重複片段序列如SEQ ID NO 2的41-214位核苷酸所示。實施例2、構建含ー個葡萄球菌蛋白A基因単體的pET3h載體用限制型內切酶NcoI和BamH I將上述葡萄球菌蛋白A基因単體切下，與經NcoI 及BamH I酶切的載體pET3h連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨苄青黴素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切鑑定後證明葡萄球菌蛋白A基因単體已克隆至pET3h中。實施例3、含有葡萄球菌蛋白A基因的pET3h-P載體的構建將上述含ー個葡萄球菌蛋白A基因単體的pET3h載體及葡萄球菌蛋白A基因單體以AccI酶切，回收相應片段後連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨苄青黴素抗性的轉化子， 經質粒提取，酶切篩選獲得含有3個蛋白A基因単體的葡萄球菌蛋白A的pET3^-P載體，
4經檢測，其基因序列如SEQ ID No:2所示。實施例4、表汰葡萄球菌蛋白A的大腸桿菌菌株的構建用CaC12法將pET3^_P轉化BL21 (DE3)，在含有氨苄青黴素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含有pET3^的重組轉化子BL21/pET32a。實施例5、牛產葡萄球菌蛋白A5. 1、菌種的培養發酵挑取大腸桿菌工程菌BL21/pET32a，接種於LB培養基中，接種量1 2% V/V，於 30°C培養過夜，次日在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1 10-1 5接種於發酵培養基上，30°C發酵至0. D600達到0. 4 0. 8，升溫至42°C誘導，3 5小時後離心收菌。取少量細胞加2X上樣緩衝液，進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結果顯示重組蛋白 A已在BL21/pET32a中誘導可溶表達。5. 2、表達的葡萄球菌蛋白A的純化將步驟5. 1中收集的菌體用磷酸鹽緩衝液(0. 2M，pH7. 0-8. 0，含有0. IMNaCl)懸浮，超聲破碎，4°C離心，收集上清，得粗提液。將粗提液使用SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示大部分葡萄球菌蛋白A被粗提，殘存於菌體的量極微將粗提液進行kphacryl 5200分子篩純化，收集特徵峰(第二洗脫峰) 即為純化的葡萄球菌蛋白A(命名為ftOtein A 1)，其純度可達90%以上，其胺基酸序列如 SEQ ID No 1 所示。採用與實施例1-5相同或相似的方法，分別製備、純化了 5種不同的葡萄球菌蛋白 A (分別命名為ProteinA2-6)，核苷酸序列分別如SEQ ID No :4、6、8、10和12所示，對應的胺基酸序列分別如SEQ ID No :3、5、7、9和11所示。實施例6、ELISA檢測葡萄球菌蛋白A與抗體結合活性採用ELISA法檢測葡萄球菌蛋白A與抗體結合活性，具體過程如下1)包被在96孔板中每孔包被葡萄球菌蛋白A樣品100ul，37°C，Ih ；2)封閉每孔以 IOOul 的的 BSA 封閉，37°C，lh ；3)加ー抗每孔加入約IOOug人IgG抗體，37°C，Ih ；4)加ニ抗每孔加入約IOOul，1 1000辣根過氧化物酶標記抗體，37°C，Ih ；5)顯色。經ELISA檢測顯示，Protein A 1、3、4、6與人IgG抗體結合活性強，每孔包被 2. 5-4. 5ng葡萄球菌蛋白A即可獲得明顯的檢測信號，因此可用於抗體的檢測，而ftOteinA 2和ftOteinA 5的效果相對較差，分別需要8. 2和9. 6ng葡萄球菌蛋白A才可獲得檢測信號。實施例7、葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP的製備分別使用實施例5製備的ftOtein A 1-6製備葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP, 具體過程如下1、用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖(5%的交聯瓊脂糖凝膠)在水介質中進行反應，在30-60°C的溫度下反應2-3小吋，反應完後用蒸餾水清洗至中性後抽乾；2、將上述產物分別與ftOteinA 1-6在5_25°C溫度下反應15_20小時，反應完後清洗再抽乾，即得到葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP，分別對應ftOtein A 1_6命名為5SCP-1-5SCP-6。經檢測，製備的葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠5S CP1-6特性如表1所示表1、製備的5S CP的特性
權利要求
1.ー種葡萄球菌蛋白A，其特徵在幹，所述葡萄球菌蛋白A的胺基酸序列如SEQ ID NO 1、5、7或11所示。
2.編碼如權利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列，其特徵在幹，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO :2、6、8 或 12 所示。
3.—種重組表達載體，其特徵在幹，所述表達載體含有權利要求2所述的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特徵在幹，所述表達載體是pET3^-P。
5.ー種宿主細胞，其特徵在幹，所述宿主細胞轉化有權利要求3或4所述的表達載體。
6.如權利要求5所述的宿主細胞，其特徵在幹，所述及的宿主細胞是大腸桿菌。
7.如權利要求6所述的宿主細胞，其特徵在幹，所述及的大腸桿菌是BL21(DE3)。
8.如權利要求1所述的葡萄球菌蛋白A用於抗體檢測、分離、純化的應用。
9.一種親和層析介質，其特徵在幹，所述親和層析介質由權利要求1所述的葡萄球菌蛋白A與層析介質載體組成。
10.如權利要求10所述的親和層析介質，其特徵為，所述層析介質載體是瓊脂糖凝膠、 葡聚糖、纖維素、矽膠或帶羥基的高分子聚合物。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄球菌蛋白A、編碼葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列以及該葡萄球菌蛋白A與層析介質載體組成的親和層析介質。本發明提供的葡萄球菌蛋白A的胺基酸序列如SEQ ID NO1、5、7或11所示。使用本發明提供的葡萄球菌蛋白A製備的親和層析介質具有蛋白結合特異性強，親和力高，純化效率大大改善的優點，與市售的ProteinA Sepharose 4Fast Flow相比，其動態吸附載量明顯提高。
文檔編號G01N33/53GK102558315SQ20101058141
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者倪華, 王進秋, 胡輝, 郭亞軍 申請人:上海抗體藥物國家工程研究中心有限公司