診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑的製作方法
2023-06-03 14:28:16 1
專利名稱：診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬醫學免疫學診斷技術領域，特別涉及結核分枝桿菌ESAT6蛋白作為皮膚變態反應原在結核菌感染檢測中的應用。
背景技術：
在全世界結核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，1985年以來愛滋病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美發達國家結核病發病率呈回升趨勢，尤其是結核菌耐藥問題和非結核分枝桿菌病的發病率逐年上升使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增結核病人800～1000萬，每年死亡人數約300萬。1993年世界衛生組織(WHO)史無前例地宣布「全球結核病緊急狀態」，1998年又重申遏制結核病的行動刻不容緩。
中國的結核病疫情和耐藥情況都相當嚴重，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查初步結果表明，中國有5.5億人感染了結核菌；現有肺結核病人451萬，其中傳染性肺結核病人196萬；每年死亡人數約13萬，結核病死亡在中國各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位；分離出的分枝桿菌中，結核分枝桿菌佔86.4％，牛分枝桿菌佔2.5％，非結核分枝桿菌佔11.1％，非結核分枝桿菌的比率較前明顯增加。因此，結核病的早期診斷、鑑別診斷和流行病學調查對結核病的早期、有效化療和控制結核菌傳播都有極其重要的意義。
舊結核菌素、純蛋白衍化物(PPD)是結核分支桿菌培養濾液蛋白，其作用於人體會激發已致敏機體產生細胞免疫反應，激活T淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，釋放大量細胞因子，並使這些細胞增殖、聚集，包裹抗原形成結節，這就是遲髮型變態(DTH)反應，其反應強度與細胞免疫呈平行關係。舊結核菌素不易標準化和易發生非特異性反應，目前已經很少使用。PPD皮膚試驗已成為目前臨床上最常用且最簡便的一種結核菌感染診斷方法，反應越強，表示結核感染可能性越大，中國一直使用硬結≥5mm為陽性，≥20mm或有水泡、壞死、淋巴結炎等為強陽性，3歲以下兒童≥15mm為強陽性的標準。但由於PPD中含有許多分支桿菌(包括致病性分支桿菌、環境中非致病性分支桿菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮試陽性並不能鑑別是因為結核分支桿菌複合群感染，還是接觸環境中非結核分支桿菌或卡介苗接種後造成的致敏。因此，PPD皮試診斷結核菌感染的特異性差，用該方法進行結核病流行病學抽樣調查獲得的結核菌感染率是不準確的，並不能真正反映人群中結核菌感染的實際狀況。目前許多國家的學者都在研究新的抗原作為皮膚變態反應原，以期建立新的結核皮膚診斷試劑。
38kDa蛋白又稱為Phos蛋白、抗原78、Pab蛋白、抗原5，是脂蛋白，既存在於分枝桿菌細胞內，又分泌於細胞外，是結核分枝桿菌培養濾液中的主要成分之-，其編碼序列與大腸桿菌磷酸結合蛋白Phos有51％的同源性。目前的研究已表明天然的38kDa蛋白和重組的38kDa蛋白的免疫原性一致，均可誘導結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌致敏的豚鼠產生DTH反應，缺乏種特異性；38kDa蛋白(抗原5)也可誘導PPD皮試陽性的人體產生典型的DTH反應，但似乎其特異性和敏感性均不如PPD；進一步研究發現38kDa蛋白抗原C末端附近存在一個免疫原性強的T細胞抗原決定簇，其合成多肽38.G(350-369位胺基酸)是結核分枝桿菌複合群特異的，可誘導結核分枝桿菌、BCG致敏小鼠和PPD皮試陽性的健康人產生DTH反應。與PPD相比，合成多肽38.G特異性有所改善，能鑑別結核分枝桿菌複合群和非結核分枝桿菌感染，但依然不能鑑別結核分枝桿菌感染和BCG接種。因此，38kDa蛋白不能作為結核病特異的皮膚診斷試劑。
6kDa早期分泌抗原靶(6kDa early secretory antigenic target，簡稱ESAT6)蛋白是一種低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，ESAT6蛋白未經糖基化，理論上推導的分子量為9,904Da，等電點為pI4.5。但經雙向凝膠電泳和免疫印跡轉移分析發現該蛋白有兩個等電點pI4和pI4.5，這可能與蛋白質的修飾有關，如醯胺側鏈的脫醯胺作用、氧化作用或磷酸化作用。在未變性條件下，凝膠過濾和SDS-PAGE顯示其分子量為24kDa，可能是該蛋白的自然構型為多聚體所致；在變性條件下，SDS-PAGE顯示其分子量為6kDa；而質譜分析其分子量為9,890±10Da，未發現多聚體形式，說明所形成的多聚體之間的聯繫可能是非常弱的。它由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和少數致病性分枝桿菌基因組的RD1區域編碼，但所有卡介苗菌株及絕大部分環境分枝桿菌基因組均丟失該區域，不表達ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多個T淋巴細胞抗原表位，該蛋白或其多肽可作為T細胞刺激抗原，用於診斷結核菌感染、活動性結核病；目前也在研究其作為疫苗的可能性。但尚未見其作為人用結核皮膚變態反應原的研究報導。
發明內容
本發明的目的是為克服已有技術的不足之處，提供一種診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，可用於鑑別卡介苗接種者、特異地檢測結核菌感染的皮膚診斷變態反應原，用於人類結核菌感染的檢測及其使用方法、劑量和判斷標準。
本發明提出的一種診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，其特徵在於，所述的結核變態反應原採用結核分枝桿菌ESAT6蛋白。
所述的ESAT6蛋白可為天然的結核分枝桿菌ESAT6蛋白或通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白。
所述的皮膚試劑可為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白濃度為6ug-15ug；本發明還提出將結核分枝桿菌ESAT6蛋白作為結核變態反應原用於人體皮膚試驗，檢測結核感染者和結核病患者，鑑別卡介苗接種者的特異性皮膚試劑。
本發明用於人體的上述結核皮膚診斷變態反應試劑的具體使用方法包括以下步驟
吸取結核皮膚診斷變態反應試劑0.1ml，所述的皮膚試劑為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌ESAT6蛋白濃度為6ug-15ug；皮內注射於人的前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應(即有無過敏、水泡、淋巴結炎等症狀)。反應硬結平均直徑≥5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑≥5mm、＜10mm者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑≥10mm、＜20mm者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑≥20mm均屬強陽性反應。
每個結核感染者皮內注射0.6ug以上均可引起遲髮型變態反應，實際應用(從經濟核算的角度)時，注射0.6ug-1.5ug的ESAT6即可，皮內注射後72小時左右是人皮膚反應較理想的觀測時間，與PPD反應不同，不會出現水泡、壞死、淋巴管炎、淋巴結炎等症狀。
本發明的特點及技術效果本申請人研究證明應用結核分枝桿菌ESAT6蛋白作為結核變態反應原製備成診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，可引起結核感染的人體產生免疫應答。該試劑可特異地誘導結核感染者產生遲髮型變態反應，可鑑別是BCG接種、環境中非結核分枝桿菌感染後造成的致敏還是真正的結核分枝桿菌感染，可用於結核菌感染檢測、結核病臨床診斷和鑑別診斷、機體免疫反應監測。
具體實施例方式
實施例11.診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。
(3)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白，使其濃度為1Sug/ml；(4)混勻後除菌濾過，檢定，分裝入一容器，1ml/支，置4℃避光保存備用(若保存得當，可保持活性一年)。
2.上述皮膚試劑在人體的應用(1)吸取上述皮膚試劑0.1ml，皮內注射於人的前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應；(2)結果判定標準反應硬結平均直徑≥5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑≥5mm、＜10mm者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑≥10mm、＜20mm者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑≥20mm均屬強陽性反應)。
實施例21.診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑的製備(1)採用天然結核分枝桿菌ESAT6蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至6.8，加雙蒸餾水定容至2000ml。
(3)用稀釋液稀釋所述的ESAT6蛋白，使其濃度為6ug/ml；(4)混勻後除菌濾過，檢定，分裝入一容器，1ml/支，置4℃避光保存備用(若保存得當，可保持活性一年)。
2.本發明的皮膚診斷試劑的應用(1)吸取上述的皮膚診斷試劑0.1ml，皮內注射於人的前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應。
(2)結果判定標準反應硬結平均直徑≥5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑≥5mm、＜10mm者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑≥10mm、＜20mm者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑≥20mm均屬強陽性反應)。
實施例31.診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.0，加雙蒸餾水定容至2000ml。
(3)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白，使其濃度為10ug/ml；(4)混勻後除菌濾過，檢定，分裝入一容器，1ml/支，置4℃避光保存備用(若保存得當，可保持活性一年)。
2.本發明的上述皮膚診斷試劑在人體的應用(1)吸取上述的皮膚診斷試劑0.1ml，皮內注射於人的前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應。
(2)結果判定標準反應硬結平均直徑≥5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑≥5mm、＜10mm者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑≥10mm、＜20mm者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑≥20mm均屬強陽性反應)。
表1為採用本實施例製備的診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑誘發本申請人的結核病中心工作人員皮膚反應結果。
表1
(2)結果分析張翠英和張俊仙PPD和本實施例的試劑皮膚試驗均呈強陽性反應，說明她們2人均已感染了結核分枝桿菌，結核分枝桿菌很可能在體內增殖活躍，需要預防治療；李洪敏、朱紅、吳雪瓊PPD皮膚試驗呈強或中等陽性反應，但本實施例的試劑皮膚試驗中等或弱陽性反應，說明她們感染了少量結核分枝桿菌，不需要預防治療；張靈霞和鄭越雖然PPD皮膚試驗呈中等陽性反應，但本實施例的試劑皮膚試驗均陰性，說明他們PPD皮膚試驗陽性是接觸環境中非結核分枝桿菌或卡介苗接種後造成的致敏，並沒有感染結核分枝桿菌；曹立雪來自農村，不知是否接種卡介苗，上肢也未見卡痕，其PPD皮膚試驗弱陽性而本實施例的試劑皮膚試驗陰性，說明其PPD皮膚試驗弱陽性很可能是接觸環境中非結核分枝桿菌所致；李娟和翟興情PPD、本發明的皮膚診斷試劑皮膚試驗均陰性，說明她們既未感染分枝桿菌，也未接種卡介苗。10名志願者中，1人PPD皮膚試驗出現水泡，而本發明的皮膚診斷試劑皮膚試驗無1人出現過敏、水泡、淋巴結炎等症狀。
通過上述實驗結果證明本發明可用於鑑別卡介苗接種者，特異地檢測結核菌感染者及結核病患者。
權利要求
1.一種診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，其特徵在於，所述的結核變態反應原採用結核分枝桿菌ESAT6蛋白。
2.如權利要求1所述的診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，其特徵在於，所述的ESAT6蛋白為天然的結核分枝桿菌ESAT6蛋白或通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白。
3.如權利要求1所述的診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，其特徵在於，所述的皮膚試劑為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌ESAT6蛋白濃度為6ug-15ug。
4.將ESAT6蛋白作為結核變態反應原用於人體皮膚試驗，檢測結核感染者和結核病患者，鑑別卡介苗接種者的特異性皮膚試劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟吸取結核皮膚診斷變態反應試劑0.1ml，所述的皮膚試劑為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌ESAT6蛋白濃度為6ug-15ug；皮內注射於人的前臂掌側中央；注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑，並記錄有無異常反應；判斷標準反應硬結平均直徑≥5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑≥5mm、＜10mm者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑≥10mm、＜20mm者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑≥20mm均屬強陽性反應。
全文摘要
本發明涉及診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑，屬醫學免疫學診斷技術領域，本發明的特異性皮膚試劑，由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，所述的結核變態反應原採用結核分枝桿菌ESAT6蛋白。本發明還提出將結核分枝桿菌ESAT6蛋白作為結核變態反應原用於人體皮膚試驗，檢測結核感染者和結核病患者，鑑別卡介苗接種者的特異性皮膚試劑。本發明可引起結核感染的人體產生免疫應答。該試劑可特異地誘導結核感染者產生遲髮型變態反應，可鑑別是BCG接種、環境中非結核分枝桿菌感染後造成的致敏還是真正的結核分枝桿菌感染，可用於結核菌感染檢測、結核病臨床診斷和鑑別診斷、機體免疫反應監測。
文檔編號A61K39/04GK1683009SQ200510055288
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月18日 優先權日2005年3月18日
發明者吳雪瓊, 張靈霞, 張翠英, 張俊仙, 史迎昌, 朱琳 申請人:中國人民解放軍第三○九醫院