一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙及其製備方法
2023-05-27 13:46:21
專利名稱：一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種嗜肺軍團菌抗原的檢測試紙及其製備方法，特別是涉及一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙及其製備方法。
背景技術：
軍團菌(Legionella)是1976年發現的。當時美國退伍軍人於費城集會，期間暴發流行了一種原因不明的嚴重肺炎，與會者149人感染，34人死亡。從死者肺組織中分離得到一種新菌，命名為軍團菌。目前，已發現的軍團菌屬有43個種、65個血清型，其中與人類疾病關係最密切的為嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila，LP)，研究表明，80％～85％的軍團菌肺炎由LP引起，現已發現15個血清型的LP。
軍團病(Legionnarires′disease，LD)是由軍團菌感染引起的一種急性細菌性呼吸道傳染病，以軍團菌肺炎和龐蒂亞克熱為主要表現，易暴發流行。近年來，國外有許多軍團病疫情的報導2000～2002年，僅歐洲就共報導軍團病189次，10322人感染。我國也有軍團病小規模疫情的發生2000年1月，北京市某新兵訓練營地發生了軍團病，發病率為89％；2000年7月，因空調系統冷凝水導致的龐蒂亞克熱型軍團病在某寫字樓員工中發生，發病率為61.9％。
大多數軍團病患者有與其它病原體引起的非典型肺炎一致的臨床表現，如咳嗽、發熱和肌痛，胸部X片顯示肺部浸潤現象等，故常導致誤診、漏診，未經治療的軍團病患者死亡率達25％。由於嗜肺軍團菌是引起軍團菌肺炎的主要病原體，故對其的快速檢測顯得尤為重要。嗜肺軍團菌抗原檢測的方法很多，例如ELISA、PCR、免疫傳感器技術等。但在實踐中，這些方法的使用暴露出一些共同的劣勢，例如實驗必須在專門的實驗室中進行；需要電源和特殊的儀器；操作人員必須經過專門培訓；實驗系統不容易標準化，為使結果可信，需要進行多次預試驗和設立多項對照；試驗操作步驟繁瑣，至少需要2小時以上。
免疫膠體金技術是近年來迅速發展的快速檢測技術，該技術與其它方法比較，優勢在於檢測過程中標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，並可迅速觀察結果，很適合突發事件現場和基層使用。
發明內容
本發明目的是提供一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。
為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙(ICA試紙)，包括樣品墊、緊密連接於所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團菌血清抗原的抗體標記膠體金探針的金標墊、與所述金標墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有嗜肺軍團菌抗原特異性抗體，所述質控線含有能與所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體。
所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體，所述嗜肺軍團菌抗原可為嗜肺軍團菌血清1型抗原、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原，優選為嗜肺軍團菌血清1型抗原，所述免疫動物的選擇是多種多樣的，如兔、猴、雞或鼠等常用的免疫動物；所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體優選為抗兔抗抗體，尤其優選為羊抗兔IgG；所述檢測線含有的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的濃度可為5-7mg/mL，所述質控線含有的能與嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體的濃度可為3-5mg/mL。
所述吸水墊和樣品墊均由吸水材料製備。
檢測樣品時可將上述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的樣品墊直接浸於樣品中；為使使用更加方便，所述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的背面還緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應於樣品墊的部位設有點樣口，對應於檢測線和質控線的部位設有觀測窗。
本發明的第二個目的是提供一種製備上述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的方法。
本發明所提供的製備上述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)製備嗜肺軍團菌抗原特異性抗體和嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體；將嗜肺軍團菌抗原特異性抗體溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區域形成質控線，然後將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離所述測試帶的一端；2)製備嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；
3)將在步驟2)中得到的金標墊上遠離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙。
在上述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法中，步驟1)中所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體，所述嗜肺軍團菌抗原可為嗜肺軍團菌血清1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原，優選為嗜肺軍團菌血清1型抗原，所述免疫動物的選擇是多種多樣的，如兔、猴、雞或鼠等常用的免疫動物，優選為兔；所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體優選為抗兔抗抗體，尤其優選為羊抗兔IgG；所述檢測線含有的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的濃度可為5-7mg/mL，所述質控線含有的能與嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體的濃度可為3-5mg/mL。
步驟1)中所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的製備方法可為採用皮下多點注射方式進行免疫，每隻注射嗜肺軍團菌抗原2mg/mL，同時加注福氏佐劑0.1mL/只，共免疫4-6次(優選為5次)，每次間隔10天，末次免疫10天後對免疫動物血清進行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，達到1∶32以上即可採血，對抗血清進行純化，得到嗜肺軍團菌抗原特異性抗體。
步驟1)中的乾燥溫度可為30-45℃，優選為37℃，乾燥時間可為2.5-3.5小時。
步驟2)中嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液的製備方法可包括以下步驟A.將HAuCl4配製成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸，攪動下準確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)水溶液，繼續加熱煮沸(優選為10-12分鐘)，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻後用水恢復至原體積；B.將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調至8.5-9.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為48μg/mL的嗜肺軍團菌血清抗原特異性抗體，攪拌25-35分鐘，加入5mL 10％BSA，攪拌20-30分鐘，再加入1mL 10％ PEG20000，攪拌20-30分鐘，先在20,000-23,500rpm下離心25-35分鐘，吸出上清，再將上清在10000-12000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，用0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液洗滌沉澱，並將其保存於8-10mL0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液中，得到嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的膠體金探針溶液。
在上述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液的製備方法中，可用K2CO3溶液或HCl溶液調pH值為8.5-9.5，所述調節pH值的K2CO3溶液的濃度可為0.15-0.25M，優選為0.2M；所述調節pH值HCl溶液的濃度可為0.08-0.12mol/L，優選為0.1mol/L。為彌補因加熱蒸發損失的水分，可用水將膠體金溶液恢復至原體積。
為使嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結合，可向步驟2)中的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；為使金標墊更易與纖維素膜粘貼，可將金標墊在-20℃至-50℃冷凍10-12小時，並將其冷凍抽乾後，再與纖維素膜粘貼。
所述吸水墊和樣品墊均由吸水材料製備。
檢測樣品時可將上述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的樣品墊直接浸於樣品中為使使用更加方便，所述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的背面還緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應於樣品墊的部位設有點樣口，對應於檢測線和質控線的部位設有觀測窗。
在實際應用中，所述纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜，寬度控制在2.5-3.0mm為宜；所述吸水墊可為吸水紙，寬度為20-40mm，厚度為0.1-0.2mm；所述金標墊的寬度為5-10mm；所述樣品墊為玻璃纖維膜，寬度為20-40mm。
本發明提供了一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙及其製備方法。該試紙利用了免疫膠體金技術及雙抗體夾心檢測法，用其檢測嗜肺軍團菌或嗜肺軍團菌抗原的基本原理是用嗜肺軍團菌抗原特異性抗體包被纖維素膜，用以捕捉標本中的嗜肺軍團菌或嗜肺軍團菌抗原，然後用標記了嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體的免疫膠體金探針進行檢測。本發明的免疫層析試紙具有以下優點1)敏感性及特異性高實驗室考核結果顯示，本發明的免疫層析試紙可用於檢測嗜肺軍團菌血清1-10型抗原標本，並且不與其它生物發生交叉反應；2)檢測方法簡單、快速檢測過程中標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，並可迅速觀察結果，標本中的嗜肺軍團菌或嗜肺軍團菌經過約5分鐘的紙層析後，即可出現肉眼可見的沉澱線，從而為嗜肺軍團菌病的治療爭取了時間，很適合突發事件現場和基層使用；3)製備方法簡單，成本低廉，易於進行工業化生產。本發明將在嗜肺軍團菌的檢測及其相關疾病的診斷和治療中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的正面和縱截面結構示意圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
材料
硝酸纖維膜(NC膜)、樣品墊和吸水濾紙，購自Millipore公司。
塑料背板，購自北京燕華公司。
實施例1、檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備一、嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體的製備1、嗜肺軍團菌血清1型抗原的製備將嗜肺軍團菌血清1型菌株(購自軍事醫學科學院微生物流行病研究所菌種庫，保藏號510101)接種在BCYE平板上，置於37℃、5％ CO2孵箱中培養，觀察平板上的菌落形態，挑取典型的單個菌落，轉接置BCYE斜面，置於37℃、5％ CO2孵箱中培養3-5天。將培養的斜面用無菌PBS(0.01M pH7.2)洗下菌苔，8000rpm離心25分鐘，棄上清，收集菌體沉澱；每克溼重菌體懸浮在10mL 0.1M NaOH溶液中，室溫攪拌1小時；濃醋酸調溶液pH值至3.0，8000rpm離心20分鐘，棄沉澱，將上清用5N NaOH調至pH值為6.5-7.0，所得溶液用PBS(0.01M pH7.0)透析48小時，得到嗜肺軍團菌血清1型抗原，凍幹保存。
2、嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體的製備選用體重2kg健康雌性大耳白家兔(購自中國人民解放軍軍事醫學科學院動物中心)，將福氏完全佐劑與步驟1獲得的嗜肺軍團菌抗原混合乳化後皮下多點注射進行免疫，免疫劑量為2mg/mL/只，分別於初次免疫後的第20日、第30日、第40日追加免疫水劑1針，追加劑量和途徑與初次免疫相同，末次免疫後10天對免疫動物血清進行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，結果為1∶64(1∶32以上即可)採血，採用常規的飽和硫酸銨鹽析法對抗血清進行純化，即用33％飽和硫酸銨鹽析2次，透析脫鹽後收集抗體，得到嗜肺軍團菌抗原特異性抗體。採用紫外分光光度儀測定上述製備的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體蛋白的濃度，方法為將蛋白適當稀釋，分別在280nm及260nm波長下測定A值，根據以下公式計算得到蛋白濃度蛋白含量(mg/mL)＝(1.45A280nm-0.74A260nm)稀釋倍數。
結果按照上述方法純化所得的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體蛋白的濃度為180mg/mL。
3、製備免疫膠體金探針1)製備膠體金溶液採用檸檬酸鹽還原法製備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4(購自Sigma公司，1g/瓶包裝)配製成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)水溶液，液體顏色穩定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。冷卻後用蒸餾水恢復至原體積，製成顆粒直徑為25nm的膠體金顆粒。
2)確定膠體金偶聯抗體飽和濃度用0.2M K2CO3溶液(或0.1M HCl溶液)調節膠體金溶液pH 8.5-9.5，準備6支潔淨試管，分別加入lmL膠體金溶液。將經純化的嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體稀釋為lmg/mL，分別向5支試管中加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，另一支為對照，混勻後於室溫下放置5分鐘，加入10％NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘後觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，即為穩定1mL膠體金所需抗體的最適濃度，以此為基礎增加20％抗體量，即為膠體金偶聯抗體飽和濃度。結果表明維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為40μl，即40μg/mL，選擇偶聯抗體濃度為48μg/mL。
3)金標墊的製備按上述方法配製含有濃度為48μg/mL的嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體免疫膠體金探針溶液50mL，攪拌30分鐘(25-35分鐘均可)，加10％ BSA5mL，攪拌25分鐘(20-30分鐘均可)，加1mL 10％PEG20000，攪拌25分鐘(20-30分鐘均可)，20,000～23,500rpm離心25分鐘(20-30分鐘均可)，棄上清，將沉澱用四硼酸鈉洗滌1次後用四硼酸鈉保存液收集沉澱5mL。取嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體免疫膠體金探針溶液5mL加入0.5g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維膜上，-35℃(-20℃～-50℃均可)放置11小時(10-12小時均可)，凍幹機抽乾，得到金標墊。
4、嗜肺軍團菌抗原快速檢測試紙的製備如圖1所示(圖中a為檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的正面結構圖，圖中b為檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的縱截面結構圖)，檢測霍亂弧菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上設有檢測線5和質控線6，該試紙的製備方法包括以下步驟1)NC膜3的包被用0.01M pH7.2的PB緩衝液(NaH2PO4·2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，去離子水1000mL)稀釋嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體，濃度為6mg/mL，用於包被檢測線。用0.01MpH7.2 PBS(NaH2PO4·2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，NaCl 8.5g，去離子水1000mL)稀釋羊抗兔IgG，濃度為4mg/mL，用於包被質控線。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴於2.5mm厚的硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線5和質控線6，37℃乾燥2.5-3.5h。
2)嗜肺軍團菌抗原快速檢測試紙的製備將吸水墊4用雙面膠粘貼在包被的硝酸纖維膜3的一端；將包被的NC膜3用雙面膠粘貼在步驟2中製備的金標墊2的一端；在金標墊2上用雙面膠粘貼玻璃纖維膜樣品墊1；再最後將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙，加乾燥劑後密封保存。
5、檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試劑盒的製備為了方便使用，將步驟3製備的嗜肺軍團菌抗原快速檢測的免疫層析試紙的下面再緊密連接一塑料背板，再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，加乾燥劑後密封保存。該試劑盒對應於樣品墊的部位設有點樣口，對應於對照帶和測試帶的部位設有觀測窗。
6、嗜肺軍團菌抗原快速檢測試紙的使用方法和原理測定時將試紙條樣品墊1浸入液體標本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動，流經金標墊2時使乾片上的免疫金複合物溶液，並帶動其向硝酸纖維膜3滲移。若標本中有待測特異抗原，其可與免疫金複合物的抗體結合，此抗原抗體複合物流至檢測線5即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應線條。過剩的免疫金複合物繼續前行，至質控線6與固相抗兔抗抗體結合，而顯出紅色質控線條。反之，陰性標本則無反應線條，而僅顯示質控線條。
實施例2、嗜肺軍團菌抗原的檢測及與其它相關細菌的交叉試驗一、不同血清型嗜肺軍團菌抗原的檢測實施例1步驟一中嗜肺軍團菌血清1型抗原的製備方法同樣適用於嗜肺軍團菌其它血清型抗原的製備，用由軍事醫學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供的嗜肺軍團菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型菌株按實施例1的方法製備的抗原分別稀釋成濃度為100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL的樣品檢測液備用。
取實施例1製備的裝有本發明檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的試劑盒，分別於點樣口中加入上述樣品檢測液3滴(約150ul)，2分鐘後開始觀察結果，15分鐘觀察終止。
結果報告僅於質控觀測窗口「C」(質控線)處出現1條紅色沉澱線為陰性，即無嗜肺軍團菌抗原檢出；於檢測觀測窗口「T」(檢測線)和質控觀測窗口「C」(質控線)處出現2條紅色沉澱線為陽性，即有嗜肺軍團菌抗原檢出；如質控觀測窗口「C」(質控線)處未出現紅色沉澱線，則說明檢測試紙失效，此時無論檢測觀測窗口「T」(檢測線)處是否出現沉澱線，檢測結果不成立。
用實施例1製備的包被嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對上述嗜肺軍團菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型檢測液進行檢測，檢測結果均為陽性，證明本發明的免疫層析試紙可用於各個血清型的嗜肺軍團菌抗原的快速檢測。
二、其它相關細菌的交叉試驗由軍事醫學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供的濃度為100μg/mL鼠疫菌410050株F1抗原作為樣品檢測液備用。
用實施例1製備的包被嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對上述鼠疫菌410050株F1抗原樣品檢測液進行檢測，結果為陰性，證明本發明的免疫層析試紙可用於各個血清型的嗜肺軍團菌抗原的快速檢測，特異性高。
實施例3、實驗室考核1、樣品製備實驗共使用細菌10株，其中9株嗜肺軍團菌(株號為510101-5101010，購自軍事醫學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心)，1株鼠疫菌(株號為410050，購自軍事醫學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心)。將上述細菌分別接種至各自適宜的培養基，並在不同的條件下培養後提取抗原，嗜肺軍團菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型抗原分別稀釋成濃度為100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL和10ng/mL，鼠疫菌F1抗原濃度為100μg/mL，作為檢測液備用。
2、實驗方法用實施例1製備的包被嗜肺軍團菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對步驟1製備的嗜肺軍團菌抗原快速檢測試劑進行檢測，取上述用不同菌株製備的嗜肺軍團菌抗原快速檢測試劑，分別於樣品墊上加入上述樣品檢測液3滴(約150μl)，2分鐘後開始觀察結果，15分鐘觀察終止。
結果報告僅於質控觀測窗口「C」(質控線)處出現1條紅色沉澱線為陰性，即無嗜肺軍團菌抗原檢出；於檢測觀測窗口「T」(檢測線)和質控觀測窗口「C」(質控線)處出現2條紅色沉澱線為陽性，即有嗜肺軍團菌抗原檢出；如質控觀測窗口「C」(質控線)處未出現紅色沉澱線，則說明檢測試紙失效，此時無論檢測觀測窗口「T」(檢測線)處是否出現沉澱線，檢測結果不成立。
3、實驗結果嗜肺軍團菌抗原快速檢測試劑的實驗室考核結果如表1所示，從表1可以看出，本發明的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙可以檢出10ng/mL的嗜肺軍團菌血清1型抗原，10μg/mL嗜肺軍團菌血清2、3、4、5、6、7、9、10型抗原，且不與100μg/mL鼠疫菌F1抗原發生交叉反應。上述檢測結果證明本發明的免疫層析試紙可用於各個血清型的嗜肺軍團菌抗原的快速檢測，並具有較高的靈敏度及特異性。
表1 嗜肺軍團菌抗原快速檢測試劑(膠體金法)實驗室考核
權利要求
1.一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接於所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團菌血清抗原的抗體標記膠體金探針的金標墊、與所述金標墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有嗜肺軍團菌抗原特異性抗體，所述質控線含有能與所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體。
2.根據權利要求1所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙，其特徵在於所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體；所述嗜肺軍團菌抗原為嗜肺軍團菌血清1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原；所述免疫動物為兔、猴、雞或鼠；所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體為抗兔抗抗體；所述檢測線含有的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的濃度為5-7mg/mL，所述質控線含有的能與嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體的濃度為3-5mg/mL。
3.根據權利要求1所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙，其特徵在於所述檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的背面緊密連接一背板。
4.一種製備權利要求1所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)製備嗜肺軍團菌抗原特異性抗體和嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體；將嗜肺軍團菌抗原特異性抗體溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的抗抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區域形成質控線，然後將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離所述測試帶的一端；2)製備嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；3)將在步驟2)中得到的金標墊上遠離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙。
5.根據權利要求4所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於所述步驟1)中的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體；所述嗜肺軍團菌抗原為嗜肺軍團菌血清1型抗原、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原；所述免疫動物為兔、猴、雞或鼠；所述檢測線含有的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的濃度為5-7mg/mL，所述質控線含有的能與嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體的濃度為3-5mg/mL。
6.根據權利要求4所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於所述步驟1)中嗜肺軍團菌抗原特異性抗體的製備方法為將福氏完全佐劑與嗜肺軍團菌抗原混合乳化後皮下多點注射進行免疫，免疫劑量為2mg/mL/只，共免疫4-6次，每次間隔10天，末次免疫10天後對免疫動物血清進行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，達到1∶32以上後採血，對抗血清進行純化，得到嗜肺軍團菌抗原特異性抗體。
7.根據權利要求4所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於所述步驟1)中的乾燥溫度為30-45℃，乾燥時間為2.5-3.5小時。
8.根據權利要求4所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於所述步驟2)中嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液的製備方法包括以下步驟A.將HAuCl4配製成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸，攪動下準確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱煮沸，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻後用水恢復至原體積；B.將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調至8.5-9.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為48μg/mL的嗜肺軍團菌血清抗原特異性抗體，攪拌25-35分鐘，加入5mL 10％BSA，攪拌20-30分鐘，再加入1mL 10％PEG20000，攪拌20-30分鐘，先在20,000-23,500rpm下離心25-35分鐘，吸出上清，再將上清在10000-12000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，用0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液洗滌沉澱，並將其保存於8-10mL0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液中，得到嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的膠體金探針溶液。
9.根據權利要求8所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於所述步驟B中用K2CO3溶液或HCl溶液調pH值；所述調節pH值的K2CO3溶液的濃度為0.15-0.25M；所述調節pH值HCl溶液的濃度為0.08-0.12mol/L。
10.根據權利要求4-9任一項所述的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的製備方法，其特徵在於向所述步驟2)中的嗜肺軍團菌抗原特異性抗體標記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；將金標墊在-20℃至-50℃冷凍10-12小時，並將其冷凍抽乾後，再與纖維素膜粘貼；在所述步驟3)獲得的檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙的背面緊密粘貼一背板；所述纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述吸水墊為吸水紙；所述樣品墊為玻璃纖維膜。
全文摘要
本發明公開了一種檢測嗜肺軍團菌抗原的免疫層析試紙及其製備方法。該試紙包括樣品墊、緊密連接於所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團菌血清抗原的抗體標記膠體金探針的金標墊、與所述金標墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜和緊密連接於所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有嗜肺軍團菌抗原特異性抗體，所述質控線含有能與所述嗜肺軍團菌抗原特異性抗體特異結合的抗抗體。本發明的免疫層析試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優點，適於臨床和現場使用。
文檔編號G01N33/532GK101074956SQ200710119068
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月19日 優先權日2007年6月19日
發明者端青, 汪黎, 李豔, 柏長青, 朱虹, 檀華, 何君, 左婷庭, 宋立華 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所