軍團菌dna提取試劑盒及提取軍團菌dna的方法

2023-05-27 13:38:36

軍團菌dna提取試劑盒及提取軍團菌dna的方法
【專利摘要】本發明涉及一種臨床樣本及環境水樣本中軍團菌DNA提取方法及提取試劑盒。即通過疊氮鈉、Chelex-100溶液，使標本中的蛋白質變性，在蛋白酶K充分消化作用後，通過Chelex-100將非核酸有機物螯合，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質與DNA分離，從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，DNA得以純化回收。本發明的方法可以在較短時間內同時提取多個樣品，正常工作時間小於60min，獲得適合後續分子生物學分析的DNA樣品。本發明方法建立的試劑盒獲得的DNA樣品純度高，且在單管操作，可有效避免因轉換而引起的汙染，成本低廉，使用範圍廣泛。
【專利說明】軍團菌DNA提取試劑盒及提取軍團菌DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因組DNA分離純化【技術領域】，具體是一種基因組DNA試劑盒及其用於快速從臨床標本及環境水樣本中提取軍團菌DNA的方法。
【背景技術】
[0002]軍團菌是一種兼性胞內寄生菌，是引起人類軍團菌病的重要病原體。近年來，軍團菌病在世界各地時有爆發流行，我國已將其例入14種新發傳染病之一。據國外報導，院內不明原因肺炎感染有10%是由軍團菌引起。目前已知軍團菌雖有52個種，70多個血清型。因此，軍團菌的鑑定對於軍團菌病診斷具有重大價值。
[0003]DNA的提取是分子生物學研究的基礎技術，提取的DNA的純度及結構完整性是進行細菌分子生物學研究的基礎。軍團菌的鑑定主要依靠分子分型檢測技術，主要包括傳統的聚合酶鏈反應(PCR)電泳及探針雜交檢測方法、擴增長度多態性分析(AFLP)、限制性片段長度多態性分析(RFCP)、隨機擴增多態性分析(RAPD)、限制性酶切分析、DNA測序分析等。但以上的檢測方法均需要高質量DNA的提取。目前，細菌基因組DNA提取方法常見的有鹼裂解法、Chelex-1OO法、溶菌酶法、煮沸法及SDS裂解法等，而Chelex-100法、煮沸法作為一種簡單有效地快速DNA提取方法，廣泛應用於細菌DNA的提取，但常規的Chelex-1OO法、煮沸法在處理臨床標本時都具有一定的局限性。本發明對傳統的Chelex-100法、煮沸法加以改良，建立了一種有效地軍團菌及及其他病原菌的快速簡便、經濟適用並能滿足臨床需要的基因組DNA提取方法及提取 試劑盒。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種快速從臨床標本及環境水樣標本中獲得軍團菌基因組DNA的方法，並提供成套的軍團菌基因組DNA提取試劑盒。
[0005]為了實現以上目的，本發明提供一種軍團菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、
0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200 μ g/ml蛋白酶K組成。
[0006]同時，本發明還提供一種提取軍團菌DNA的方法，包括以下步驟，
[0007]先配置200ml的DNA提取液:稱取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10 μ 1，調Ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無菌水至200ml ;最後再加入IOg的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合後，於-20°C保存；
[0008]再提取軍團菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置於55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置於13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團菌基因組DNA。
[0009]本發明使用疊氮鈉、Chelex-100溶液，最大程度的使臨床標本及環境水樣標本中的蛋白質變性，在蛋白酶K充分消化作用後，利用Chelex-100除去非核酸有機物，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質與DNA分離。從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，使DNA得以純化回收。
[0010]根據本發明的方法建立的試劑盒可以在60min時間內同時提取多個樣品，獲得的DNA可直接用於後續分子生物學分析，不僅可用於軍團菌基因組DNA的提取，也可用於其他病原細菌基因組DNA的提取，具有廣闊的應用前景。
[0011]本發明根據上述方法配置的DNA提取液，通過一系列優化建立的軍團菌基因組DNA提取試劑盒，其主要優點如下:
[0012](I)無需專門抽提蛋白質、沉澱DNA、洗滌DNA和溶解DNA，所用試劑少，提取成本低
廉
MTv ο
[0013](2)單管操作，提取過程中不需要更換基因組DNA的器皿，可有效避免交叉汙染。
[0014](3)試劑盒配置簡單，操作方法簡單快速。
[0015](4)使用範圍廣泛，除軍團菌外，對其他細菌基因組DNA的提取也有很好的效果。【具體實施方式】
[0016]本發明從臨床標本及環境水樣本中提取軍團菌基因組DNA為具體實施例，進一步闡述本發明。
[0017]1、軍團菌DNA提取試劑盒的製備
[0018]
【權利要求】
1.一種軍團菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，其特徵在於:所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200μ g/ml蛋白酶K組成。
2.一種提取軍團菌DNA的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 先配置200ml的DNA提取液:稱取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10μ 1，調ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無菌水至200ml ;最後再加入IOg的Chelex-1OO溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合後，於_20°C保存。 再提取軍團菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置於55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置於13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團菌基因組DNA。`
【文檔編號】C12N15/10GK103509785SQ201210349441
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】朱慶義, 胡朝暉, 趙利偉 申請人:上海金域醫學檢驗所有限公司