構建應用於高質量噬菌體抗體庫的表達載體的製作方法
2023-05-27 11:25:06
專利名稱：構建應用於高質量噬菌體抗體庫的表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種構建應用於高質量噬菌體抗體庫的表達載體。
背景技術：
噬菌體抗體庫技術的發展和應用為抗體技術領域帶來了巨大的變化，已被廣泛應 用於生物學、醫學等各個研究領域，通過基因工程和噬菌體展示技術的結合，能得到人源化 的針對幾乎所有抗原表位的抗體，這極大地推動了各種性能優良抗體及多功能抗體融合蛋 白的開發和應用。噬菌體抗體庫模擬了天然抗體庫，使得人們可以不經過複雜的免疫過程， 而是直接利用抗原就可以從抗體庫中篩選出特異性抗體成為可能。它既解決了人源性單抗 的來源困難、人體雜交瘤系統的低效及鼠單抗的動物源性等難題，也使得單克隆抗體的制 備變得簡單易行，穩定有效，使人單克隆抗體的製備有了突破。但是，此技術目前還有許多 問題尚待解決，如在保證抗體庫的多樣性和呈現效率的同時，如何提高有效庫容量、如何在 構建抗體庫時提高抗體基因連接效率等問題上，還有待進一步解決。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種載體。本發明提供的載體，按照如下方法製備1)將McB的編碼基因1插入到pDF的多克隆位點間，得到中間載體PSBX ；2)將步驟1)得到的中間載體PSBX的BssHII酶切位點改為BglII酶切位點，得到 中間載體PSGX ；3)將&icB的編碼基因2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe I和NcoI酶 切位點間，得到載體pDF-D-SacB ；所述McB的編碼基因1為序列表的序列1自5』末端第30-1908位核苷酸；所述McB的編碼基因2為序列表中的序列2自5』末端第7-1857位核苷酸。步驟1)中，所述將McB的編碼基因1插入到pDF的多克隆位點為將McB的編碼 基因1插入到pDF的BssHII和Xba I酶切位點間。本發明的另一個目的是提供一種載體。本發明提供的載體按照如下方法製備1)以pUc19-&iCB為模板，用引物對1進行PCR擴增，得到PCR產物1，將PCR產 物1插入到pDF的BssHII和Xba I酶切位點間，得到中間載體PSBX ；所述PCR產物1即為 SacB的編碼基因1，所述McB的編碼基因1為序列表的序列1自5』末端第30-1908位核
苷酸；所述引物對1中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，所述引物對1中的 另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；2)將步驟1)得到的中間載體PSBX上的BssHII酶切位點改變為BglII酶切位點， 得到中間載體PSGX ；
3)以pUC19-&iCB為模板，用引物對2進行PCR擴增，得到PCR產物2，將得到的 PCR產物2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe I和Nco I位點間，得到重組載體 PDF-D-SacB ；所述PCR產物2即為&icB的編碼基因2，所述&icB的編碼基因2為序列表中 的序列2自5』末端第7-1857位核苷酸；所述引物對2中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列7，所述引物對2中的 另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列8。上述將BssHII酶切位點改為BglII酶切位點按照如下方法進行A 將中間載體PSBX用BssHII酶切後，再加入鹼性磷酸酶去磷酸化，得到去磷酸化 的PSBX線性片段；B:將含有BglII的引物對在98°C-20°C進行退火，得到退火的引物對，再 向退火的引物對進行磷酸化處理，得到磷酸化的退火引物對；C:將磷酸化的退火引物對和去磷酸化的PSBX線性片段連接，得到中間載體 PSGX ；所述含有BglII的引物對中的一條引物為序列表中的序列3，另一條引物為序列 表中的序列4。所述將含有BglII的引物對在98°C _20°C進行退火，具體為將含有BglII的引物 對在 98°C、90°C、80°C、70°C、60°C、50°C、40°C、30°C和 20°C進行退火。含有所述的載體的轉基因細胞系或重組菌或重組病毒也是本發明保護的範圍。所述的載體或所述轉基因細胞系或重組菌或重組病毒在製備噬菌體抗體庫中的 應用也是本發明保護的範圍。所述應用中，所述抗體為抗B肝表面抗原抗體。本發明的實驗證明，將抗體基因插入自殺載體(含有自殺基因McB)後，自殺基因 失去功能，而沒有插入抗體基因的自殺載體，自殺基因表達自殺蛋白，表達該蛋白的革蘭氏 陰性菌在含有蔗糖的培養基中生長時，會將蔗糖分解為對細菌有毒的產物，從而殺死表達 該蛋白的細菌。具體為通過向PDF重、輕鏈區域插入McB基因，並改造抗體基因克隆位點， 構建了 PDF-D-SacB載體；經檢測，pDF-D-SacB可以表達具有功能的Fab噬菌體抗體，可以 在分泌Cre蛋白酶的細菌胞內發生預期的Cre-Loxp介導的定點重組；pDF-D-SacB中選用 了抗體胚系可變區基因中不存在的內切酶位點，以保證內切酶序列不會影響到成熟抗體分 子氨基端的序列，將酶切位點BssHII改為Bglll，從而極大地提高了抗體基因的連接效率， 減少了工作量。因此，使用自殺基因作為反篩基因與抗性基因等正向篩選基因聯合，用於構 建細菌的無痕缺失突變株，用這種方法構建的抗體庫質量和穩定性均有提高；本發明的噬 菌粒載體PDF-D-SacB為構建大容量噬菌體抗體庫提供了有效工具，同時增加了抗體對抗 原識別的多樣性。噬菌粒載體pDF-D-SacB構建的抗體庫，不僅容量大，而且質量更高，理論 上可以得到近於100%的有效克隆；為淘選各種類型的抗原的噬菌體抗體打下堅實的研究 ■石出。
圖1為驗證PUC19-&1CB的自殺功能圖2為PCR擴增McB基因純化回收圖3為EcoR I酶切鑑定1 %凝膠電泳圖
圖4為Dra I酶切鑑定1 %凝膠電泳圖(輕鏈)圖5為Dra I酶切鑑定1 %凝膠電泳圖(重鏈)圖6為pDF-D-SacB所表達的噬菌體抗體的ELISA檢測結果圖7為pDF-D-SacB的結構示意圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、載體PDF-D-SacB的獲得大腸桿菌transl-Blue購自北京全式金生物有限公司；噬菌體VCSM13、BS1365 菌、表達載體PDF由海軍總醫院周麗君教授饋贈；Pucig-McB質粒由軍事醫學科學院疾病 預防控制所黃留玉研究員饋贈；帶有抗B肝病毒表面抗原(HBsAg)人Fab段基因的質粒 B4-HFLF由本室保存。Phusion, BssHII，Xba I，Nco I，Nhe I，BglII，鹼性磷酸酶，購自 New EnglandBiolabs(NEB) W] ；EcoR I, Dra I, T4 DNA Ligase, T4 Plolynucleotide Kinnase (PNK) _ 自 TaKaRa ( i； ) ^ W] ；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit, EasyPure Quick Gel ExtractionKit 購自北京全式金生物有限公司；5000DNA Marker, DL2000DNA Marker購自北京博邁德公司；1、驗證pUC19_&icB的自殺功能1) pUC 19-SacB (王玉飛、陳澤良、喬鳳、汪舟佳、杜昕穎、苑錫銅、黃留玉，布魯氏 菌自殺載體的構建及其在突變株構建中的應用，世界華人消化雜誌，2007年9月觀日， 15(27) J934-2937;公眾可從軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。)轉入大腸桿菌 中，吸取100 μ 1加入到5ml無抗性液體LB培養基中，在37°C搖床上220r/min振搖至飽和， 用挑菌棒蘸取少量該菌液，在含有氨卞抗性的固體LB培養基上劃線，放入37°C溫箱中過 夜。從平板上挑取攜帶有pUC19-&iCB質粒的單克隆至3ml含有氨卞抗性液體LB培 養基中，在37°C搖床中220r/min振搖IOh至對數生長期；取上述菌液200 μ 1分別加入到 預先準備好5ml含有氨卞抗性液體LB培養基和含有氨卞抗性及5%蔗糖液體LB培養基兩 支試管中，在37°C搖床上220r/min振搖5h，結果見圖IA所示，從圖中看出，在僅含有氨卞 抗性液體LB培養基中菌生長，但是在含有氨卞抗性及5%蔗糖的培養基中菌未生長，表明， pUC19-SacB在蔗糖環境下有自殺功能。將兩支試管的菌液分別從KT1稀釋至10_9，各取每個稀釋梯度的菌液5 μ 1，加入到 預先準備的含有氨卞抗性固體LB培養基平板上相應的格子中，放入37°C溫箱中，次日觀察 結果。結果見圖IB所示，由圖IB可以看出在含有Amp抗性液體LB培養基中生長的大腸 桿菌(左圖)，在10—1至10_5均有克隆，且KT1-IO-3稀釋倍數克隆無法計數，在10_4有86個 單克隆，在10_5有11個單克隆；而在含有Amp抗性及5%蔗糖液體LB培養基中(右圖)生 長的大腸桿菌KT1至10_5均無克隆。表明大腸桿菌在是否含蔗糖的培養基環境裡，生長相 差5個數量級，說明PUC19-&CB質粒帶有自殺功能，進一步證明自殺基因McB的功能。2、設計引物
為了提高輕鏈抗體基因連接效率，設計了兩條引物來改造原始噬菌粒載體 PDF(喬媛媛、王琰、陳曉穗、王欲曉、化冰，大容量噬菌體抗體庫的構建及鑑定，中華微生物 學和免疫學雜誌，2004年3月第M卷第3期，194-197，公眾可從軍事醫學科學院微生物 流行病研究所獲得。)上用以連接輕鏈抗體基因的酶切位點BssHII，其新的酶切位點為 Bglll，同時設計用於克隆McB自殺基因的引物序列來構建抗體庫載體，具體引物序列見 表1-1，以及用於克隆抗B肝表面抗原抗體的引物序列，具體引物見表1-2，所有引物均由 上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表1-1引物序列
權利要求
1.一種載體，按照如下方法製備1)將McB的編碼基因1插入到PDF的多克隆位點間，得到中間載體PSBX；2)將步驟1)得到的中間載體PSBX的BssHII酶切位點改為BglII酶切位點，得到中間 載體PSGX ；3)將McB的編碼基因2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的NheI和NcoI酶切位 點間，得到載體PDF-D-SacB ；所述McB的編碼基因1為序列表的序列1自5』末端第30-1908位核苷酸；所述McB的編碼基因2為序列表中的序列2自5』末端第7-1857位核苷酸。
2.根據權利要求1所述的載體，其特徵在於步驟1)中，所述將McB的編碼基因1插入到pDF的多克隆位點為將McB的編碼基因 1插入到pDF的BssHII和XbaI酶切位點間。
3.一種載體，按照如下方法製備1)以puC19-&iCB為模板，用引物對1進行PCR擴增，得到PCR產物1，將PCR產物1插 入到pDF的BssHII和Xba I酶切位點間，得到中間載體PSBX ；所述PCR產物1即為SacB的 編碼基因1，所述McB的編碼基因1為序列表的序列1自5』末端第30-1908位核苷酸；所述引物對1中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，所述引物對1中的另一 條引物的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；2)將步驟1)得到的中間載體PSBX上的BssHII酶切位點改變為BglII酶切位點，得到 中間載體PSGX ；3)以pUC19-McB為模板，用引物對2進行PCR擴增，得到PCR產物2，將得到的PCR產物 2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe I和Nco I位點間，得到重組載體pDF-D-SacB ； 所述PCR產物2即為McB的編碼基因2，所述McB的編碼基因2為序列表中的序列2自 5』末端第7-1857位核苷酸；所述引物對2中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列7，所述引物對2中的另一 條引物的核苷酸序列為序列表中的序列8。
4.含有權利要求1-3中任一所述的載體的轉基因細胞系或重組菌或重組病毒。
5.權利要求1-3中任一所述的載體在製備噬菌體抗體庫中的應用；或權利要求4所述轉基因細胞系或重組菌或重組病毒在製備噬菌體抗體庫中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述應用中，所述抗體為抗B肝表面抗原抗體。
全文摘要
本發明公開了一種構建應用於高質量噬菌體抗體庫的表達載體。本發明提供的載體，按照如下方法製備1)將輕鏈區域SacB的編碼基因插入到pDF的多克隆位點間，得到中間載體PSBX；2)將步驟1)得到的中間載體PSBX的BssHII酶切位點突變為BglII酶切位點，得到中間載體PSGX；3)將重鏈區域SacB的編碼基因插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe I和Nco I酶切位點間，得到載體pDF-D-SacB。本發明的實驗證明，所獲得的含自殺基因的噬菌粒載體pDF-D-SacB適用於構建大容量噬菌體抗體庫。
文檔編號C07K16/18GK102094035SQ201010565730
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者安小平, 張寶中, 潘博, 王曉娜, 童貽剛, 米志強 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所