一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法

2023-05-26 23:36:36

一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，包括：（1）採用PCR方法得到shRNA基因，並用限制性內切酶EcoRI進行酶切，得到經EcoRI酶切後的miR-505片段；（2）將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進行酶切，並CIAP處理使其5』端去磷酸化，然後將處理後的線性化FUGW載體或Fsy載體與經EcoRI酶切後的miR-505片段進行連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，提取質粒，經PCR和BamHI酶切檢測目的基因插入的方向和拷貝數，測序確認後，得到表達載體。本發明的構建方法操作簡單，得到的載體可實現miR-505成熟體在哺乳動物細胞中的高表達。
【專利說明】一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於表達載體構建領域,特別涉及一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNA是長度為21-25鹼基單鏈小分子RNA，是由具有髮夾結構的約70-90個鹼基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工後生成。自從1993年第一個miRNA被報導以來，人們發現miRNAs幾乎參與了所有重要的生物學過程的調控[1]，miRNAs的異常表達與人類多種疾病相關[2]。迄今為止，700多種已被鑑定出來的人源性miRNAs調控了人類1/3以上基因的表達。miR-505位於小鼠X染色體X: 57647578-57647667處，ATPllC基因的第一和第二外顯子之間的第一個內含子中，對於其生物學功能的研究目前還處於起步階段。
[0003]2010年，Verduci L等發現miR-505能通過作用於其靶標ASF/SF2 (可變剪接因子)發揮調控小鼠胚胎成纖維細胞的增殖和衰老/凋亡的作用[3]，Karni R等發現在許多細胞中轉染ASF/SF2可以激活mTOR部分信號通路[4]，但是ASF參與調控mTOR的具體方式還不清楚。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時,發現miR-505是一個新的腫瘤抑制miRNA,與其呈現負相關的蛋白Akt3，與mTOR通路上的AKT屬於同一基因家族[5]。因此miR-505極有可能通過調控mTOR信號通路發揮其生物學功能，而mTOR通路是目前分子生物學研究的熱點，它能整合細胞內和細胞間的信號，起到調控細胞代謝、生長、增殖和存活等過程的中心調控者的作用，mTOR通路的改變與多種疾病相關[6]。
[0004]在細胞水平對小RNA進行研究，可採用合成的雙鏈SiRNA或者構建在表達載體上的shRNA轉染細胞進行。由於有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成SiRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。採用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體，然後轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色於體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系統，它能高效的將目的基因導入動物和人的原代細胞或細胞系。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。目前慢病毒也被廣泛地應用於表達micix)RNA的研究中[7]。
[0005]1.Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism，andfunction.Cellll6(2):281-297 ；
[0006]2.Ambros V，朱萬渠(2010):MicroRNAs 與疾病和發育生命科學 3:27-29 ;
[0007]3.Verducij Lj Simili Mj Rizzo Mj Mercatanti A, Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-relatedFactor (LRF) and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J BiolChem, 285:39551-39563 ；
[0008]4.Karni R, Hippo Y, Lowe SW, Krainer AR (2008) The spl icing-factoroncoprotein S F 2/A S F activates mTORCl.Proc Natl Acad SciUSA105(40):15323-15327 ；
[0009]5.Yamamoto Y, Yoshioka Y, Minoura K, Takahashi R, Takeshita F etal., (201I)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNAand gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.MolCancer, 10:13539551-39563 ；
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[0011]7.Dittgen T, Nimmerjahn A, Komai S, Licznerski P, Waters J, MargrieTW,Helmchen F,Denk W,Brecht M, and Osten P (2004)Lentivirus-based geneticmanipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiologicalmonitoring inviv0.Proc.Natl ac sci USA.101:18206-18211。

【發明內容】

[0012]本發明所要解決的技術問題是提供一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，該方法操作簡單，得到的載體可實現miR-505成熟體在哺乳動物細胞中的高表達。
[0013]本發明的一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，包括:
[0014](1) miR-505 的 shRNA 基因的獲得
[0015]採用PCR 方法將 microRNA-505 的 shRNA 基因從 pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505擴增得到包含miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的shRNA基因，並用限制性內切酶EcoRI進行酶切，得到經EcoRI酶切後的miR-505片段；
[0016](2) FUGff-miR-505 及 Fsy-miR-505 載體的構建
[0017]將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進行酶切，並CIAP處理使其5』端去磷酸化，然後將處理後的線性化FUGW載體或Fsy載體與步驟(1)得到的經EcoRI酶切後的miR-505片段進行連接，再轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5 α，並塗布到1%氨苄抗性的瓊脂糖平板至長出菌落，對單菌落進行PCR鑑定，初步確定陽性克隆並根據PCR產物大小推測插入片段的拷貝數；將陽性克隆提取質粒後，進行BamHI的酶切，根據產物大小確認外源片段插入的方向，將正確插入的片段進行測序確認，得到表達載體。
[0018]步驟(1)中所述的PCR方法中所用的一對引物如下:
[0019]PcDNA-1eft:5』 CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG ；
[0020]PcDNA-right:5， CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
[0021]步驟(1)中所述的miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的序列長度分別為173bp、175bp、171bp。
[0022]步驟(2)中所述的連接的具體操作為4°C下過夜連接。
[0023]步驟(2)中所述的PCR鑑定中的引物為:
[0024]FUGff - EcoRlUpper:5，CATGGACGAGCTGTACAAGT ；[0025]FUGff - EcoRlLower:5』 CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
[0026]本發明構建了在哺乳動物細胞中表達miR-505的慢病毒載體，通過啟動子的選擇和多拷貝shRNA插入的篩選獲得成熟體的高表達；通過具有組織特異性表達啟動子的選擇和多拷貝shRNA插入的篩選獲得在中樞神經系統的高表達。
[0027]本發明技術方案包括用PCR方法獲得目的基因，在PCR引物兩端設計相同的酶切位點EcoRI，同時還保留了原載體上目的基因兩側的分別位於上下遊的BamHI和BglII位點，將PCR產物用EcoRI酶切後，與經相同酶切的FUGW和Fsy載體分別連接，轉化至大腸桿菌的感受態細胞。根據上述兩個載體上位於EcoRI位點兩側的序列設計引物，對菌落進行PCR篩選，初步確定陽性克隆並根據PCR產物大小推測插入片段的拷貝數。將陽性克隆提取質粒後，進行BamHI的酶切，根據產物大小確認外源片段插入的方向，將正確插入的片段進行測序確認。[0028]將構建好的miR-505慢病毒載體轉染哺乳動物細胞，48小時後，提取細胞RNA，用特異引物進行逆轉錄反應，然後用螢光定量PCR反應進行細胞內成熟體miR-505的定量以檢測轉染及表達情況。
[0029]本發明構建能高效表達microRNA-505的慢病毒載體，選用UBC作為啟動子的FUGW載體。泛素啟動子UBC為人和小鼠細胞的組成型啟動子，包含多種轉錄因子，且具有泛素系統本身的特性，與常用的病毒啟動子相比，其細胞來源的特性以及組成型表達的特點可能使它們更加適合驅動外源基因在哺乳動物細胞中的高效表達。另外，為了提高miR-505在中樞神經系統中表達的特異性，選用大鼠SynaptinI (突觸蛋白I)啟動子(FsyI)的Fsy載體。FsyI是在神經元中特異表達的啟動子,細胞實驗及體內實驗結果都證明，FsyI啟動子能指導其所調控的基因在神經元細胞中特異性高效表達。在構建上述兩種載體時，都保留了載體上的EGFP位點，以方便通過螢光顯微鏡觀察質粒的轉染效率。
[0030]本發明的工藝過程，首先採用PCR方法和帶有兩端帶有EcoRI酶切位點的引物將 microRNA505 的 shRNA 基因從 pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505 擴增，得到 miR-505_3p 和miR-505-5p的shRNA基因，EcoRI酶切PCR產物，同時FUGW和Fsy空載體經EcoRI酶切，並CIAP處理使其5』端去磷酸化；處理後的線性化載體FUGW和Fsy分別與shRNA片段4°C過夜連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5 α，提取質粒，經PCR和BamHI酶切檢測目的基因插入的方向和拷貝數，測序確認後，得到表達載體。表達載體轉染哺乳動物細胞，經螢光定量PCR確認miR-505的表達量。
[0031]以FUGW-miR505_3p為例，載體構建過程如圖7所示。
[0032]有益效果
[0033]本發明構建了能夠在哺乳動物細胞中表達外源miR-505的慢病毒載體，選擇在人和小鼠細胞中組成型表達的UBC啟動子和在神經元中特異表達的Syn啟動子,前者是為了提高外源基因表達的效率和持續性，後者可用於研究miR-505在神經元中的生物學功能，並且保留載體上的EGFP蛋白編碼基因以方便地指示轉染效率。
[0034]本發明在載體上的單酶切位點插入外源片段，儘管陽性克隆中大約有一半會以反向插入，但是，在連接過程中，也可將目的片段進行串聯形成多拷貝，在插入的目的基因上遊保留了 BamHI位點，PCR引物設計上保留了一個採用單酶切位點的方式將外源基因連接到載體上，以在設計了位於表達載體EcoRI位點兩側的PCR引物以方便用菌落PCR方法篩選陽性克隆。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1 miR505目的片段的PCR電泳圖；其中泳道l-miR505_3P，泳道2-miR505_5P，泳道 3-miR505_nc,泳道 4-marker ；
[0036]圖2菌落PCR電泳圖；其中泳道I~9-FUGW-miR505-3p，泳道10-陰性，泳道11-Marker, a箭頭指示單拷貝，b箭頭指示兩拷貝，c箭頭指示三拷貝；
[0037]圖3 FUGff-miR505-3p BamHI酶切產物電泳圖；泳道liarker，泳道2~
3-FUGff-miR505-3p單拷貝正向插入酶切產物，泳道4-FUGW-miR505_3p單拷貝反向插入酶切產物，泳道5-FUGW-miR505-3p兩拷貝正向插入酶切產物，泳道6-FUGW-miR505_3p兩拷貝-正向-反向插入酶切產物；
[0038]圖4 FUGff-miR505-3p 載體圖譜；
[0039]圖5 HEK293T 細胞轉染後 EGFP 表達，其中 A:pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505-3p,B:pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505-nc, C:FUGff-miR505-3p, D:FUGff-miR505-nc, E:L26Fsy(l.1)Gff-miR505-3p, F:L26Fsy(l.1)Gff-miR505-nc, G:FUGff-miR505-3p 單拷貝，H:FUGff-miR505-3p 兩拷貝，I:FUGff-miR505-3p 三拷貝；
[0040]圖6 miR505-3p不同拷貝數質粒在HEK293T細胞中的表達；
[0041]圖7 FUGW-miR505_3p為例，載體構建過程示意圖。`【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
[0043]實施例1
[0044]I).miR-505 的 shRNA 基因的獲得
[0045]根據基因序列設計併合成2對miR-505寡聚單鏈DNA，分別為miR-505_5p，miR-505_3p序列見表一:
[0046]表1.miRNA寡聚單鏈DNA序列(附陰性對照序列)
[0047]
【權利要求】
1.一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，包括: (1)採用PCR方法將microRNA-505 的 shRNA基因從pcDNA?6.2-GW/EmGFP_miR-505擴增得到包含miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的shRNA基因，並用限制性內切酶EcoRI進行酶切，得到經EcoRI酶切後的miR-505片段； (2)將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進行酶切，並CIAP處理使其5』端去磷酸化，然後將處理後的線性化FUGW載體或Fsy載體與步驟(1)得到的經EcoRI酶切後的miR-505片段進行連接，再轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5ci，並塗布到1%氨苄抗性的瓊脂糖平板至長出菌落，對單菌落進行PCR鑑定，初步確定陽性克隆並根據PCR產物大小推測插入片段的拷貝數；將陽性克隆提取質粒後，進行BamHI的酶切，根據產物大小確認外源片段插入的方向，將正確插入的片段進行測序確認，得到表達載體。
2.根據權利要求1所述的一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，其特徵在於:步驟(1)中所述的PCR方法中所用的一對引物如下:
PcDNA-1eft:5』 CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG ；
PcDNA-right:5』 CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
3.根據權利要求1所述的一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法,其特徵在於:步驟(1)中所述的miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的序列長度分別為173bp、175bp、171bp。
4.根據權利要求1所述的一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的連接的具體操作為4°C下過夜連接。
5.根據權利要求1所述的一種用於功能研究的miR-505高表達載體的構建方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的PCR鑑定中的引物為:`
FUGff - EcoRlUpper:5』 CATGGACGAGCTGTACAAGT ；
FUGff - EcoRlLower:5』 CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
【文檔編號】C12N15/66GK103710372SQ201310754411
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】周宇荀, 馬驍驍, 肖君華, 李凱 申請人:東華大學