競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁c肽檢測試劑盒及製備方法

2023-05-27 03:37:36

專利名稱：競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁c肽檢測試劑盒及製備方法
技術領域：
本發明涉及的是生物技術領域，具體涉及的是競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒，本發明還涉及該試劑盒的製備方法。
背景技術：
測定C肽能得知胰島細胞的功能，對糖尿病的診斷和治療具有很大的意義，C肽沒有胰島素的功能，而胰島B細胞分泌的胰島素和C肽呈等分子關係，這也就是說，分泌幾個胰島素分子，同時必然分泌幾個C肽分子。血清C肽濃度可間接反應胰島素濃度。C肽不受肝臟酶滅活，半衰期比胰島素長，經腎臟直接在尿中排洩，故血中C肽的濃度可更好地反映胰島素的功能。 正常基礎狀態下C肽水平為0. 4±0. 2納摩/升。在口服葡萄糖耐量試驗(標準饅頭餐試驗)的同時可抽血測定空腹血糖負荷後I小時、2小時、3小時的血清C肽水平，正常人在服糖60分鐘後C肽水平升高至基礎水平的3倍以上。I型糖尿病C水平極低(< 0. 2納摩/升)，胰島功能減退者餐後C肽升主的幅度常低於3倍。對於接受胰島素治療的患者，用測定血中胰島素水平不能評價自身胰島功能時，可以測定C肽水平來評價自身胰島B細胞功能。目前已有的C肽測定方法有化學/電化學發光免疫檢測、放射免疫檢測、酶聯免疫檢測，其缺點是檢測時間普遍較長(約30min )，且檢測費用昂貴。傳統的膠乳顆粒增強免疫比濁法檢測抗原物質時採用的是夾心法檢測原理，即被檢測物抗原與樣本稀釋液(試劑I)混合後孵育一定時間，再與包被有對應抗體的納米顆粒(試劑2)發生抗原抗體反應，形成不容性的免疫複合物，在全自動生化儀上表現為吸光度上升(形成一定的吸光度變化值)，這種吸光度的變化值與被測物質抗原含量正相關，使用已知濃度的標準品繪製標準曲線，則可根據被測標本的反應吸光度變化計算出其含量。其要求是抗原物質要有兩個以上的無空間位阻的抗原表位。但是，C肽由於只有31個胺基酸，無空間位阻的抗原表位較少，採用夾心法檢測難度較高。

發明內容
本發明的目的在於解決目前夾心法檢測C肽難度較高，檢測時間長的問題，提供一種速度快、檢測簡便的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒及製備方法。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下
競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩衝液組成，所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的胺基酸序列
EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X ;X 由 2 4 個 K 組成。進一步，所述反應緩衝液中含有抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體。更進一步地，所述競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒是基於免疫競爭法對檢測樣本中的C肽進行定量測定。競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒的製備方法，包括膠乳顆粒的製備和反應緩衝液的製備，所述膠乳顆粒的製備方法由以下步驟組成
(al)活化膠乳顆粒，離心，去上清，使用HEPES緩衝液復溶；
(a2)加入人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X，室溫下反應2小時；
(a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ；
(a4)離心，去上清，使用HEPES緩衝液復溶即製成成品。為了更有效的得到所需膠乳顆粒；所述離心的條件為22000rpm，離心的時間為IOmin0 作為一種優選，所述(al)中活化膠乳顆粒所採用的試劑為EDC和S-NHS。進一步，所述反應緩衝液製備過程如下
在IOOmM的MES緩衝液中力卩A終濃度為0.001 0. lmg/ml的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ 抗原表位的單克隆抗體。本發明原理是納米顆粒包被的是和被測抗原物質相同或相似的抗原，與一定量的對應的抗體發生抗原抗體反應，形成不容性的免疫複合物，在全自動生化儀上表現為形成一定的吸光度變化值。當被測物中含有此種抗原時，由於競爭原理，所形成的吸光度變化值與無被測物質時相比下降，在競爭法中吸光度的變化值與被測物質抗原含量負相關，使用已知濃度的標準品繪製標準曲線，則可根據被測標本的反應吸光度變化計算出其含量。本發明具有以下優點及有益效果
I、在C肽的抗原測定中，由於其抗原太小，較難提供形成夾心免疫複合物的多個抗原表位；使用本發明無需形成多個抗原表位，即可有效的對C肽進行檢測，使檢測方法更簡便，檢測結果更準確。2、採用本發明的試劑盒可快速對C肽進行檢測，檢測時間僅需要lOmin。3、本發明採用包被有人工合成的胺基酸EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X的膠乳顆粒以及含有抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體的反應緩衝液對C肽進行檢測；因此，本發明具有特異性好、準確性高的優點。4、通過本發明的試劑盒進行檢測，其檢測成本相對低廉，適合推廣應用。5、本發明的免疫競爭法同時適用於其他小分子抗原的測定。


圖I為本發明不同含量的C肽參考標準的標準曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不限於下列實施例。實施例I
本發明由膠乳顆粒以及反應緩衝液組成。所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X ；X由2 4個K組成。所述反應緩衝液中含有抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體。該EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ 為現有的胺基酸序列。所述人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X，由生工生物工程(上海)有限公司合成。抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體由Abcam公司提供。(a)所述膠乳顆粒的製備方法由以下步驟組成
(al)採用EDC和S-NHS活化膠乳顆粒，活化時間為15min，活化後的物質在22000rpm的條件下離心lOmin，去上清，使用HEPES緩衝液復溶；
(a2)加入人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKK，在室溫下反應2小時；
(a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ；·
(a4)在22000rpm的條件下離心lOmin，去上清，使用HEPES緩衝液復溶。根據上述步驟即可製備出本發明所需的膠乳顆粒。上述步驟中EDC為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；上述S-NHS為N-羥基硫代琥珀醯亞胺。(b)所述反應緩衝液製備過程如下
在IOOmM的MES緩衝液中力卩A終濃度為0. OOl 0. lmg/ml的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體。所述MES為脂肪酸甲酯磺酸鹽;MES緩衝液的pH為5. O 7. 5。本實施例中所採用的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0. OOl mg/ml。採用上述步驟製備出的膠乳顆粒和反應緩衝液，檢測出不同濃度下的C肽標準品的吸光度，通過該濃度和吸光度製成本發明的標準曲線；其檢測過程如下
往日立7060全自動生化分析儀器中加入本發明的膠乳顆粒和反應緩衝液，膠乳顆粒200ul,反應緩衝液50ul。再向該全自動生化儀中加入30ul的樣本。進行檢測,檢測參數反應時間IOmin, 18 31讀點，570nm單波長。標準曲線的製作過程如下採用以下標準樣本校準點濃度0. 00nmol/l,0. 5nmol/I、I. 0nmol/l、2. 0nmol/l、4. Onmo 1/1 ;用5點Spline或Log4p模式校準,通過檢測結果製作出本發明標準曲線。本實施例的標準曲線如圖I所示，其中X軸代表C肽含量，Y軸表示吸光度變化值。完成標準曲線後，即可進行標本測定，由儀器自動計算樣本中C肽含量。本實施例對9份樣本進行檢測；同時，採用德國拜耳公司的CENTAUR自動冷光免疫分析儀和C peptide檢測試劑對樣本進行檢測作為對照實驗，檢測結果如表I。實施例2
本實施例與實施例I的不同點在於膠乳顆粒包被的人工合成的胺基酸序列不同；同時，本實施例中所採用的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0.05 mg/ml。本實施例採用的人工合成的胺基酸序列為EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKKK。檢測結果如表I。實施例3
本實施例與實施例I的不同點在於膠乳顆粒包被的人工合成的胺基酸序列不同；同時，本實施例中所釆用的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0. I mg/mlo本實施例釆用的人工合成的胺基酸序列為EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKKKK。檢測結果如表I。表I
權利要求
1.競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩衝液組成，其特徵在於所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X ;X 由 2 4 個 K 組成。
2.根據權利要求I所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒，其特徵在於，所述反應緩衝液中含有抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的單克隆抗體。
3.根據權利要求I或2所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒，其特徵在於，是基於免疫競爭法對檢測樣本中的C肽進行定量測定。
4.根據權利要求I 3任一項所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒的製備方法，包括膠乳顆粒的製備和反應緩衝液的製備，其特徵在於，所述膠乳顆粒的製備方法由以下步驟組成 (al)活化膠乳顆粒，離心，去上清，使用HEPES緩衝液復溶； (a2)加入人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X，室溫下反應2小時； (a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ； (a4)離心，去上清，使用HEPES緩衝液復溶即製成成品。
5.根據權利要求4所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述離心的條件為22000rpm，離心的時間為lOmin。
6.根據權利要求5所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述(al)中活化膠乳顆粒所採用的試劑為EDC和S-NHS。
7.根據權利要求4 6任一項所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述反應緩衝液製備過程如下 在IOOmM的MES緩衝液中力卩A終濃度為0.001 0. lmg/ml的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ 抗原表位的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁C肽檢測試劑盒及製備方法，解決了目前夾心法檢測C肽難度較高，檢測時間長等問題。本發明的試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩衝液組成，其特徵在於所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的胺基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X；X由2～4個K組成。本發明還提供了該試劑盒的製備方法。本發明具有準確性高、檢測時間短、可靠性高等優點。
文檔編號G01N33/531GK102680713SQ20121020034
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者王釗 申請人:王釗