維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體外轉錄質粒的構建的製作方法
2023-05-27 12:20:16
專利名稱：維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體外轉錄質粒的構建的製作方法
技術領域：
本發明利用基因工程技術，構建了體外轉錄載體及能夠誘導豬胚胎成纖維細胞轉 變成豬多能幹細胞的6個關鍵基因的體外轉錄質粒，用於誘導豬的成纖維細胞成豬多能幹 細胞，為建立人類疾病模型提供了基本條件，該發明屬於基因工程領域。
背景技術：
豬是最適合人類器官移植和建立人類疾病模型的動物，但豬的疾病模型大多數用 基因敲除技術得到基因敲除的體細胞然後利用核移植的技術產生可繼續發育的卵母細胞， 從而得到基因敲除豬。但在這個過程中存在基因敲除效率低，孕期流產率高，初生仔豬有缺 陷等問題；此外，豬的幹細胞分離至今沒有成功，所以根據Yamanaka研究小組的實驗方法， 在成纖維細胞中轉入幾個幹細胞的關鍵基因就能將成纖維細胞轉變成多能幹細胞。目前， 利用脂質體等轉染試劑對成纖維細胞的多基因轉染效率非常低，導致轉入的基因量不同， 但用逆轉錄病毒攜帶基因用其感染成纖維細胞的方法得到的基因敲除豬又存在生物安全 性的問題。因此，我們試圖在體外大量轉錄維持幹細胞自我更新的豬的6個關鍵基因，然後 將其mRNA轉入豬胚胎成纖維細胞後使其變成豬的多能幹細胞。
發明內容
本發明的目的之一是構建基因體外轉錄載體，該載體可以對某個基因進行大量的 體外轉錄，得到可高效翻譯的mRNA。本發明的另一個目的是構建了攜帶維持幹細胞自我更新的豬的6個關鍵基因和 對照基因EGFP的體外轉錄質粒，這6個基因體外轉錄出的mRNA轉染進豬胚胎成纖維細胞 後能夠使其轉變成豬的多能幹細胞；並用細胞水平通過細胞轉染鑑定了體外轉錄mRNA的 功能。本發明的技術方案是這樣實現的維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體 外轉錄質粒的構建，其特徵在於具體製備方法如下首先設計基因體外轉錄空載體Vitr0-TranSPMD-18T，然後獲得EGFP和維持 幹細胞自我更新的豬源的6個關鍵基因的cDNA，再按相應的酶切位點進行酶切連接， 並用體外轉錄試劑盒對7個體外轉錄質粒進行體外轉錄，得到相應的mRNA，然後將 Vitro-Trans-EGFP轉染進豬胚胎成纖維細胞，檢測其功能；1、基因體外轉錄載體的構建用重疊延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7啟動子，增強翻譯效率的 minusCT，包含ATG起始密碼子的5』 UTR和一段包含酶切位點的無關序列。然後連接進入 PMD-18T simple載體，用於以後表達基因的插入。根據目的序列設計2對引物，PI, P2 ；P3, P4。用引物Pl和P2進行PCR擴增得 到60bp的序列，電泳，切膠回收，然後以60bp的產物為模板用引物P3和P4進行PCR，得到104bp的反轉錄模板序列。表1引物序列
權利要求
維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體外轉錄質粒的構建，其特徵在於具體製備方法如下首先設計基因體外轉錄空載體Vitro TransPMD 18T，然後獲得EGFP和維持幹細胞自我更新的豬源的6個關鍵基因的cDNA，並按相應的酶切位點進行酶切連接，最後用體外轉錄試劑盒對7個體外轉錄質粒進行體外轉錄，得到相應的mRNA，然後將Vitro Trans EGFP轉染進豬胚胎成纖維細胞(1)、基因體外轉錄載體的構建用重疊延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7啟動子，增強翻譯效率的minusCT，包含ATG起始密碼子的5』UTR和一段包含酶切位點的無關序列；然後連接進入PMD 18T simple載體，用於以後表達基因的插入；根據目的序列設計2對引物，P15′ tatagggagaagagggagagtagagccgccaccat 3′，P25′ attctccgcggacatatgtgggcccatggtggcgg3′；P35′ Ctcgaggactaatacgactcactataggga 3′，P45′ aagcttgctagctctcgagagaattctccg 3′；用引物P1和P2進行PCR擴增得到60bp的序列，電泳，切膠回收，然後以60bp的產物為模板用引物P3和P4進行PCR，得到104bp的反轉錄模板序列；Ctcgaggactaatacgactcactatagggagaagagggagagtagagccgccaccatgggcccacatatgtccgcggagaattctctcgagagctagcaagctt；(2)、維持幹細胞自我更新的豬源關鍵基因的cDNA的獲得利用NCBI中公布的EGFP的序列和杜洛克豬的相應基因mRNA序列，設計引物，包括Oct4(NM_001113060.1)，Sox2(NM_001123197.1)，c Myc(NM_001005154.1)，Klf4(NM_001031782.1)，Nanog(NM_001129971.1)和Lin28(NM_001123133.1)；引物兩端帶有連接體外轉錄載體的內切酶位點(NcoI，EcoRI和NheI)，採用RT PCR的方法得到這6個基因的cDNA序列；(3)、基因體外轉錄質粒的獲得將上述的體外轉錄空載體與Oct4，Sox2，c Myc，Klf4，Nanog和Lin28的7個基因的cDNA連接，得到基因的體外轉錄質粒(VitroTrans EGFP/Oct4/Sox2/c Myc/Klf4/Nanog/Lin28)；(4)、基因的體外轉錄利用Applied Biosystems公司的mMESSGE mMACHINE T7Ultra Kit對線性化的基因體外轉錄質粒進行體外轉錄；(5)、基因體外轉錄出的mRNA功能的驗證用作為對照的體外轉錄出的EGFP的mRNA對豬成纖維細胞進行轉染，12小時後觀察到綠色螢光蛋白表達。
2.根據權利要求1所述的維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體外轉錄質粒的 構建，其特徵在於所述的基因體外轉錄載體的序列及含相同元件相同功能的載體。
全文摘要
本發明涉及一種維持幹細胞自我更新的6個豬源關鍵基因的體外轉錄質粒構建，其特徵在於具體製備方法如下首先設計基因體外轉錄空載體Vitro-TransPMD-18T，然後獲得EGFP和維持幹細胞自我更新的豬源的6個關鍵基因的cDNA，並按相應的酶切位點進行酶切連接，最後用體外轉錄試劑盒對7個體外轉錄質粒進行體外轉錄，得到相應的mRNA，然後將Vitro-Trans-EGFP轉染進豬胚胎成纖維細胞其6個基因體外轉錄出的mRNA轉染進豬胚胎成纖維細胞後能夠使其轉變成豬的多能幹細胞；6個基因體外轉錄出的mRNA能夠高效翻譯。
文檔編號C12N5/10GK101984062SQ20101018240
公開日2011年3月9日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者周楊, 唐小春, 張明軍, 朱建國, 歐陽紅生, 段新平, 賴良學, 逄大欣, 陳月 申請人:吉林大學