防治十字花科作物根腫病的萎縮芽孢桿菌BA‑7的發酵方法與流程
2023-05-27 01:42:26 1
本發明屬於生物農藥技術領域，具體涉及防治十字花科作物根腫病的萎縮芽孢桿菌BA-7的發酵方法。
背景技術：
現有技術中，用於防治十字花科作物根腫病的生防菌株很少，主要集中在枯草芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌XF-1和枯草芽孢桿菌M3)和解澱粉芽孢桿菌(如解澱粉芽孢桿菌Bam22)，極大的限制了生防菌株在防治十字花科作物根腫病方面實際應用。重要的是，對於是否存在其它相應的生防菌種，研究者們還在努力的探索中。
本發明的發明人經過長時間的實驗摸索工作，成功分離出了一株對十字花科作物(特別是油菜)具有十分優秀防治效果的萎縮芽孢桿菌BA-7。對其進行發酵方法的摸索，便於更好的對其進行實際應用。
技術實現要素：
針對現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種防治十字花科作物根腫病的萎縮芽孢桿菌BA-7的發酵方法，該發酵方法包括如下步驟：
(1)將萎縮芽孢桿菌BA-7在固體培養基培養之後，挑取單菌落，置於液體培養基中，於30-32℃震蕩培養10-12小時，轉速為200-220rpm，作為種子液；所述液體培養基的成分按質量百分數計包括：酵母提取物0.1-0.4％、牛肉浸膏0.1-0.3％、蛋白腖0.6-1.0％、 NaCl 0.3-0.6％、餘量為水，pH＝7.0-7.2；
(2)將步驟1)所得物置入發酵罐中進行發酵24-48小時，罐溫為28-32℃，發酵罐攪拌速度為220-250rpm；發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計包括：豆粉4-5％、蛋白腖0.1-0.15％、葡萄糖0.5-0.7％、澱粉2-3％、硫酸錳0.1％、硫酸亞鐵0.06％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、消泡劑0.01％、餘量為水，pH＝7.0-7.4；
所述萎縮芽孢桿菌的分類命名為Bacillus atrophaeus BA-7，於2015年12月21日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山中國典型培養物保藏中心(武漢大學)，保藏號為CCTCC NO：M 2015765。
如本發明實施例所示，將本發明菌株培養24小時之後，1000倍的稀釋液具有高達87.2％(5組平行實驗平均值)的油菜根腫病防治效果。
實現上述效果的機制在於，本發明菌株本身對於病原菌具有很好的抑制和滅殺作用，使得油菜根腫病的發生率大為降低。另外，如實驗例1所示，本發明菌株對於農地中的秸稈或其它作物廢棄物具有很好的腐熟作用，施用本發明菌株培養稀釋液後，可在常溫下有效分解秸稈或其它作物廢棄物，並將藏身其中的病原菌釋放出來，通過病原菌和萎縮芽孢桿菌的直接接觸進一步實現本發明菌株對土壤中病原菌的全面作用。同時，分解後的秸稈或其他作物廢棄物還能為下一季作物的生長提供更多的有機質，促進農作物的健康生長。
一般而言，農作物秸稈的腐熟發酵多採用厭氧方式進行堆漚發酵，不僅費時費力，而且容易對周邊環境造成汙染。本發明菌株可在有氧 條件下，對秸稈進行腐熟，無需將收割後的秸稈進行集中收集和進行堆漚，僅需將本發明發酵菌液撒施入農田中，讓菌液接觸農作物秸稈便可實現對秸稈的腐熟及其後續利用。同時，當施用外源秸稈時，即使外源秸稈中帶有病原菌，根據上述說明，可以理解，本發明同樣能實現很好的防治效果。
因此，本領域人員不難理解，本發明菌株不僅具有很好的對病原菌的抑制殺滅作用，同時還可以在有氧條件下實現對秸稈的快速腐熟，使得下一季油菜大幅度免於病原菌的再次侵染並促進油菜的生長。
在上述基礎下，本發明研究了利用本發明菌株對農地進行處理的方法，可以實現對十字花科作物農地進行處理以顯著提高作物的防病效果。
值得指出的是，對於其它十字花科根腫病的防治效果也十分優秀。
現有技術中被公眾熟知的生防菌株枯草芽孢桿菌XF-1的施用濃度十分高，且一旦施用濃度過低，其防治效果將大為降低，極大的限制了其實際應用。
其它常見的生防菌株也多為枯草芽孢桿菌。雖然本發明的發明人此前發現了一株對十字花科作物根腫病具有很好防治效果的解澱粉芽孢桿菌Bam22，拓寬了該領域十字花科生防菌株的菌種範圍，然而在本飯前，現有技術還未出現可從萎縮芽孢桿菌中尋求高效防治十字花科作物根腫病的菌株的報導和相應的指示。
另外，本發明的發明人發現利用本發明的發酵方法利於菌的生長，可以很好的發揮出菌株的生防效果。
優選的，步驟(1)中，所述液體培養基的成分按質量百分數計為：酵母提取物0.13％、牛肉浸膏0.2％、蛋白腖0.8％、NaCl 0.5％、餘量為水，pH＝7.0-7.2。
優選的，步驟(2)中，所述培養基的的成分按質量百分數計為：豆粉4.5％、蛋白腖0.12％、葡萄糖0.6％、澱粉2.5％、硫酸錳0.1％、硫酸亞鐵0.06％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、消泡劑0.01％、餘量為水，pH＝7.0-7.4。
優選的，步驟(2)中，所述罐溫為30℃。
優選的，步驟(2)中，所述發酵時間為24小時。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用於對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述發明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
實施例1
1、菌株的培養
(1)將萎縮芽孢桿菌BA-7在固體培養基培養之後，挑取單菌落，置於液體培養基中，於30-32℃震蕩培12小時，轉速為220rpm，作為種子液；所述液體培養基的成分按質量百分數計包括：酵母提取物0.3％、牛肉浸膏0.2％、蛋白腖0.8％、NaCl 0.3-0.6％、餘量為水，pH＝7.0-7.2；
(2)將步驟(1)所得物置入發酵罐中進行發酵24小時，罐 溫為30℃，發酵罐攪拌速度為250rpm；發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計包括：豆粉4.5％、蛋白腖0.12％、葡萄糖0.6％、澱粉2.5％、硫酸錳0.1％、硫酸亞鐵0.06％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、消泡劑0.01％、餘量為水，pH＝7.0-7.4。
2、生防效果實驗
將上述1部分所得培養物稀釋1000倍，利用澆根法，移栽時對每株作物澆100ml，隔7天澆一次，隔14天再澆一次。註：未稀釋菌液的菌濃約為6-8×109cfu/ml。受試作物為油菜、白菜和青花菜。各實驗組設5個平行組，取平均值。
病情分級：
0級：根部無腫瘤，根系發育正常；
1級：1-30％的根著少許腫瘤，有小的結節狀腫塊，相互不連接；
2級：31-60％的根著生腫瘤，有大的結節狀或球狀腫塊，相互連接；
3級：61-100％的根著生腫瘤，膨大到形成紡錘形瘤，大的瘤塊一直延伸到下胚軸，植株矮小，停止生長。
病情指數＝[Σ(各級病株數×相對級數值)/最高級別×調查總株數]×100。
相對防效＝(對照病情指數-處理病情指數)×100/對照病情指數。
實驗結果如表1所示。
表1
註：清水對照的病情指數為62％。
實施例2
在菌株培養方面，除步驟(1)液體培養基的成分為酵母提取物0.1％、牛肉浸膏0.1％、蛋白腖0.6％、NaCl 0.6％、餘量為水，pH＝7.0-7.2；發酵培養基的成分為豆粉4％、蛋白腖0.1％、葡萄糖0.5％、澱粉2％、硫酸錳0.1％、硫酸亞鐵0.06％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、消泡劑0.01％、餘量為水，pH＝7.0-7.4；發酵溫度為28℃，時間為48小時；其餘與實施例1一致。所得菌液濃度為4-5×109cfu/ml。
實施例3
在菌株培養方面，除步驟(1)液體培養基的成分為酵母提取物0.1-0.4％、牛肉浸膏0.3％、蛋白腖1.0％、NaCl 0.3％、餘量為水，pH＝7.0-7.2；發酵培養基成分為豆粉5％、蛋白腖0.15％、葡萄糖0.7％、澱粉3％、硫酸錳0.1％、硫酸亞鐵0.06％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、消泡劑0.01％、餘量為水，pH＝7.0-7.4；發酵溫度為32℃，發酵時間為36小時；其餘與實施例1一致。所得菌液濃度為7-8×108cfu/ml。
實驗例1
農田：油菜田；
在秸稈收割機上安裝一排菌劑噴灑裝置，用於在收割秸稈的同時將菌劑噴灑至農田。
收割粉碎農田中的秸稈，並向農田施用萎縮芽孢桿菌BA-7菌劑，施用量為20000億個細菌/畝。所述菌劑為萎縮芽孢桿菌BA-7發酵液，菌濃為1×109cfu/ml。
處理45天之後，進行秸稈失重率(全稱為秸稈生物量失重率)的檢測，失重率為61.3％。