一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基的製作方法
2023-06-17 01:18:36 1
本發明屬於細胞培養基領域，特別涉及一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基。
背景技術：
：皮膚顏色主要由皮膚製造的色素和皮膚表層所含天然色素的組合所決定。皮膚上皮層表面的表皮中含有能製造皮膚色素(即黑色素)的表皮黑素細胞。色素減退或無色素性皮膚病患者的皮膚黑素細胞缺失、被破壞或無功能，從而在身體各部位出現白斑。白癜風是一種特殊的皮膚色素性疾病，以出現白斑和表皮黑素細胞缺失為主要特徵。當前治療包括光敏劑(如補骨脂素)聯合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用皮質類固醇(腎上腺)，但療效低，並伴隨一定副作用。外科移植技術已經應用於白癜風治療，如負壓吸皰移植、刃厚皮片移植或微小皮片移植。這些治療在局限性和小面積病損的患者中有效。但對白斑面積大或者白斑數量多的患者，獲得足夠的移植皮片具有一定困難。要成功地進行大面積的自體表皮移植，需有大的移植皮片，內含大量細胞，特別是黑素細胞。或者，可通過細胞培養大量擴增自體黑素細胞用於移植。這種方法需要從病人健康皮膚取得黑素細胞，在體外將其培養在合適環境中(可促進細胞增殖、遷移和黑素製造)使之大量擴增，再在合適條件下將細胞移植至病人病變處皮膚，使之恢復正常顏色。關於黑素細胞培養基已有報導，Olsson等報告的表皮黑素細胞培養基配方，包含PC-1，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，丁醯環腺苷酸(dbcAMP)，青黴素-鏈黴素。該培養基用於在自體黑素細胞移植中擴增分離得到表皮黑素細胞。此培養基不包含促進黑素細胞生長和分化必需的血清。此外，bFGF的濃度(5ng/ml)太低，不能刺激表皮黑素細胞作足夠的生長。而dbcAMP不是一種天然物質，作用時間也很短。另外，對所培養細胞的數量和黑素含量均無量化指標報導，因此，很難評價這一培養基的效率。另外的培養基，如HU16(FIC培養基)已被我們用於培養表皮黑素細胞。HU16培養基包括F12培養基(一種商品化的基礎培養基)，補充有效濃度的bFGF、IBMX，霍亂毒素和胎牛血清。該培養基已經在中國臺灣成功應用於120例白癜風患者黑素細胞移植治療中的黑素細胞培養。另一種表皮黑素細胞培養基(HU74)，含有bFGF、肝細胞生長因子(HGF)、腎上腺素和α-MSH，已經建立並在美國成功申報專利(美國專利6943024和7132279)。雖然培養表皮黑素細胞的培養基很多，但都不是最佳的。因此，一些患者因為細胞生長不佳，必須長時間等待；另一小部分患者細胞生長差，達不到移植需要。另外，一些移植成功的病人在移植區域的邊緣缺乏色素形成，這可能與培養基不能有效刺激細胞的遷移有關。中國專利CN101735976B公布了一種用於表皮黑素細胞體外培養的培養基，可用於培養增殖能力、遷移能力和黑素合成能力增強的表皮黑素細胞。但依舊含有5-30％的血清，血清的整個流程極其複雜，造價高昂，而且血清中可能帶有朊病毒，血清的批次質量也缺少穩定性。技術實現要素：本發明目的是提供一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基新配方，解決了血清中可能帶有朊病毒，血清的批次缺少穩定性等問題。本發明採用的技術方案是：一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基，1包括基礎培養基及以下成分和濃度：人轉鐵蛋白15-100mg/L、胰島素10-30mg/L、穀氨醯胺1-10mg/L、β-成纖維細胞生長因子0.1-5ug/L、表皮生長因子5-10ug/L、腎上腺素50-300ug/L，鏈黴素1-30mg/L、氯化鈣10-50mg/L、硝酸鐵0.1-1mg/L、亞硒酸鈉1-10ug/L、硫酸銅1-10ug/L、硫酸鋅0.1-1mg/L、維生素E0.1-30mg/L、乙醇胺0.1-50mg/L磷酸乙醇0.1-10mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷5.3-6.2ug/L。優選地，所述用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基，由基礎培養基及以下成分和濃度組成：人轉鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈黴素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇10mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷為5.4ug/L。優選地，所述的基礎培養基為Ham’sF12與現有技術相比，本發明培養基具有以下優點：1.本發明培養基，是一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基，解決了血清中可能帶有朊病毒，血清的批次缺少穩定性等問題。2.本發明培養基培養黑素細胞能力與現有黑素細胞培養基功能相當，且本發明培養基對黑素細胞分泌黑素有意外的促進作用。具體實施例下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此。實施例1一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基由以下成分及其濃度組成：人轉鐵蛋白15mg/L、胰島素10mg/L、穀氨醯胺1mg/L、β-成纖維細胞生長因子0.1ug/L、表皮生長因子5ug/L、腎上腺素50ug/L，鏈黴素1mg/L、氯化鈣10mg/L、硝酸鐵0.1mg/L、亞硒酸鈉1ug/L、硫酸銅1ug/L、硫酸鋅0.1mg/L、維生素E0.1mg/L、乙醇胺0.1mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷6.2ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎培養基。實施例2一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基由以下成分及其濃度組成：人轉鐵蛋白100mg/L、胰島素30mg/L、穀氨醯胺10mg/L、β-成纖維細胞生長因子5ug/L、表皮生長因子10ug/L、腎上腺素300ug/L，鏈黴素30mg/L、氯化鈣50mg/L、硝酸鐵1mg/L、亞硒酸鈉10ug/L、硫酸銅10ug/L、硫酸鋅1mg/L、維生素E30mg/L、乙醇胺50mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷5.3ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎培養基。實施例3一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基由以下成分及其濃度組成：人轉鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈黴素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷5.4ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎培養基。對比例1一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基一種用於表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基由以下成分及其濃度組成：人轉鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈黴素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁醯環磷酸腺苷6.5ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎培養基。與實施例3相比，雙丁醯環磷酸腺苷濃度增加。試驗一、培養的表皮黑素細胞的細胞生長檢測1.試驗對象：實施例1-3得到的表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基2.試驗方法：(1)表皮黑素細胞的分離和培養細胞樣本在0.25％(w/v)胰酶(GIBCO，Carlsbad，Calif.)中在37℃溫度下孵育15分鐘，0.2％(w/v)EDTA(Sigma，St.Louis，Mo.)中繼續孵育10分鐘。用鑷子小心的將皮片上的表皮細胞分離下來，形成表皮細胞懸液。表皮細胞離心後，種植在25cm2的培養瓶中。培養瓶放置在37℃溫度下的CO2培養箱中(95％空氣，5％CO2)。3天後，加入100μg/ml基因素以去除角質形成細胞和成纖維細胞。每3天換液一次。黑素細胞一般在2周後基本融合。細胞融合後，用胰酶-EDTA溶液脫下，離心，稀釋，傳代培養。在移植時，黑素細胞用胰酶-EDTA溶液脫下，離心後用F12培養基重懸。(2)表皮黑素細胞的細胞生長檢測表皮黑素細胞以2×104/孔的密度接種於24孔板，24h後，分別採用實施例1、2、3及對比例1中的培養基進行培養。每3天換液一次。6天後，用胰酶-EDTA脫下細胞，以含10％血清的培養基終止消化。細胞懸液離心後，用200μlF12培養基重懸沉澱，用Pasteur移液管轉移20μL的細胞懸液至血球計數器，在光學顯微鏡下觀察。計數4個1mm3區域中的細胞。細胞數量用下面的公式1計算，四次計數，取平均值。所有實驗樣本都重複3次。公式1：c＝0.2×n×104c＝細胞量(cells/mL)；n＝細胞計數。(3)實驗結果，不同培養基中表皮黑素細胞量檢測結果，如表1所示：表1不同培養基中表皮黑素細胞量所用培養基細胞量(104cells/mL)實施例1540實施例2530實施例3550對比例1408由表1可知，在培養6天後，本發明配製得到的細胞基中細胞量均高於對比例培養基中黑素細胞量，並且實施例3配製得到的培養基培養黑素細胞量最多。試驗二、培養的表皮黑素細胞的黑色素含量檢測1.試驗對象：實施例1-3及對比例1得到的表皮黑素細胞體外培養的無血清培養基2.試驗方法：表皮黑素細胞以2×104/孔的密度接種於24孔板。24h後，分為四組，組1、組2、組3、組4，分別採用實施例1、2、3及對比例1配製得到的培養基。每3天換液一次。6天後將黑素細胞用胰酶-EDTA脫下並用血球計數器進行計數。再將細胞懸液離心，沉澱用1N的NaOH溶液溶解。通過分光光度計在475nm處檢測溶液的光密度值，對照用合成的黑素(Sigma，St.Louis，Mo.)所做的標準曲線算出黑素含量。實驗結果，如表2所示。表2不同培養基中表皮黑素細胞的黑色素含量由表2可知，採用本發明配製得到的培養基中黑素細胞分泌黑色素的量均高於對比例1，實施例3中培養基所得黑色素含量最高，與對比例1中培養基所得黑色素含量相比提高了1.69倍。由此可知，本發明配製得到的培養基對黑素細胞分泌黑色素有意外的促進作用。以上列舉的僅是本發明的具體實施例，顯然本發明不限於以上實施例，還可有許多改動。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有改動，均應認為是本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3