miR-885-5p在製備判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途的製作方法
2023-06-16 20:48:26
專利名稱：miR-885-5p在製備判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及miR-885-5p在製備判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途，具體的說是涉及通過檢測原發性肝癌組織中miR-885-5p的表達來判斷原發性肝癌臨床分期的用途，所述診斷試劑通過原位雜交技術實現對miR-885-5p表達量的的檢測。本發明的方法屬於臨床免疫檢測方法，特別是運用原位雜交方法檢測miR-885-5p從而判斷原發性肝癌臨床分期的方法。
背景技術：
原發性肝細胞癌是常見的消化道惡性腫瘤，在世界範圍內是排名第五的惡性腫 瘤，世界每年新發現惡性腫瘤病人約635萬例，其中肝癌大約佔26萬例，26萬例中42. 5%發生在我國且其發病率仍然呈逐年遞增的趨勢。肝癌發現一般為晚期，有效的治療方法為肝切除和肝移植，常規化療對肝癌治療效果並不明顯，所以肝癌的早期診斷尤為重要，探索有效的肝癌臨床診斷標記物和治療策略具有重要意義。而在診斷肝癌的過程中，除了確診是否患有肝癌外，因為不同臨床發展階段的肝癌治療措施和預後並不相同，進一步明確肝癌的臨床分期同樣非常重要。因此研究和開發合適的能夠用於準確判斷肝癌臨床分期分子標記物具有非常重要的現實意義。microRNAs(miRNAs)是一類含量豐富的非蛋白編碼小分子RNA，miRNAs主要是與靶mRNA的3' UTR區域結合，能夠抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解，調節多種生物功能。業已表明，腫瘤組織miRNAs表達譜異常與腫瘤的發生發展以及預後密切相關。一些miRNAs，如miR-17-92，可能作為致癌基因；而另一些miRNAs，如miR-15，可作為抑癌基因，它們在腫瘤的發生、發展過程中起著重要作用。同時它們在腫瘤幹細胞中也發揮著重要的作用。因此miRNAs正成為腫瘤診斷和治療的新靶點。miR-885-5p是一種已知的小分子RNA，NCBI基因庫查詢顯示該基因定位於3號染色體的ρ25· 3的10411173-10411246區間(負鏈)，由Berezikov E等克隆測序發現。現有的報導發現其與神經母細胞瘤的增殖密切相關。我們首次發現miR-885-5p在肝癌和肝炎、肝硬化病人的血清中的表達量遠遠高於正常對照組，由此推斷得出miR-885-5p的表達異常可能和肝病的發病進程有關。
發明內容
本發明通過研究發現miR-885_5p隨著肝癌臨床分期的增加，表達量明顯降低，miR-885-5p可以作為判斷肝癌臨床分期的診斷標記物，通過生物領域常用的檢測方法對肝癌組織中miR-885-5p的含量進行檢測能夠間接判斷肝癌的臨床分期。本發明通過採用生物領域常見的原位雜交方法來檢測病理組織中的miR-885_5p分子，以此判斷肝癌的臨床分期。具體來講就是，通過對病理組織的原位雜交，檢測該組織中miR-885-5p分子的表達量，根據原位雜交的結果來判斷肝癌的臨床分期。其技術內容包括原位雜交和顯微鏡觀察等步驟。石蠟包埋組織切片的原位雜交方法是本領域已知的方法，一般包括脫蠟、乙醇分級水化、蛋白酶消化、分級脫水、雜交、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟。本發明還涉及一種檢測miR-885_5p的雜交探針在製備用於判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途，其特徵在於，所述探針為丹麥公司exiqon的探針miRCURY LNA Detection probe,具體序列為5』 AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3』，其中所述的 miR-885_5p 雜交探針是經過地高辛標記的探針。使用所述診斷試劑判斷原發性肝癌臨床分期的步驟如下( I)脫蠟和水化，具體步驟如下①組織切片置於二甲苯I中浸泡5分鐘，②組織切片置於二甲苯II浸泡5分鐘， ③組織切片置於二甲苯III浸泡5分鐘，④組織切片置於99. 9%乙醇I中上下浸泡10下，⑤組織切片置於99. 9%乙醇II中上下浸泡10下，⑥組織切片置於99. 9%乙醇III浸泡5分鐘，⑦組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下，⑧組織切片置於96%乙醇II中浸泡5分鐘，⑨組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下⑩組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘，(2)組織切片置於磷酸鹽緩衝液PBS中浸泡2-5分鐘。(3)孵育蛋白酶K，將100 μ I濃度為15 μ g/ml的蛋白酶K滴加與組織切片表面，37°C孵育10分鐘。(4)用磷酸鹽緩衝液洗處理過的組織切片2次，每次五分鐘。(5)組織切片脫水，具體步驟如下①組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下，②組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘，③組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下，④組織切片置於96%乙醇II中浸泡I分鐘，⑤組織切片置於99. 9%乙醇I上下浸泡10下，⑥組織切片置於99. 9%乙醇II浸泡I分鐘。(6)探針與miR-885-5p的雜交，將雜交液(50nM) 100 μ I滴加在組織切片中，將其放入溼盒中，55°C孵育I小時。(7) SSC緩衝液洗組織切片，具體步驟如下①組織切片置於55°C的5 X SSC緩衝液浸泡5分鐘，②組織切片置於55°C的5 X SSC緩衝液浸泡5分鐘，③組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，④組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，⑤組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，⑥組織切片置於55°C的O. 2X SSC緩衝液浸泡5分鐘。
(8)封閉液封閉，室溫靜置15分鐘。(9)滴加連有鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:800) 100 μ 1，室溫靜置I小時。(10) PBST緩衝液洗3次,每次5分鐘(所述PBST緩衝液是指Phosphate BufferedSaline with Tween-20,是市場上購買獲得產品)(Il)KTBT緩衝液洗2次，每次5分鐘(所述KTBT緩衝液是指Tris Buffered Salinewith Tween-20,是市場上購買獲得產品)。(12)去離子水洗2次，每次I分鐘。(13)核固紅IOOml滴加於組織切片上染核，室溫靜置10分鐘。(14)流水洗組織切片10分鐘。 (15)脫水、透明，具體步驟如下①組織切片置於70%乙醇中浸泡30秒，②70%乙醇中浸泡I分鐘，③組織切片置於96%乙醇中上下浸泡10下④組織切片置於96%乙醇中浸泡I分鐘，⑤組織切片置於99. 9%乙醇II上下浸泡10下， ⑥組織切片置於99. 9%乙醇III浸泡I分鐘。⑦二甲苯II中浸泡5分鐘，⑧二甲苯I浸泡5分鐘。(16)樹脂封片、鏡檢。miR-885_5p 的相關基本信息為!Accession No MIMAT0004947,基本序列為5』UCCAUUACACUACCUGCCUCU3』，所採用的雜交探針為丹麥公司exiqon的探針miRCURY LNA Detection probe，具體序列為5』 AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3』，標記物為地高辛。本發明還涉及一種通過原位雜交技術判斷原發性肝癌臨床分期的試劑盒，所述試劑盒包括上述檢測miR-885-5p的雜交探針和原位雜交使用的其他常用試劑，所述其他常用試劑是本領域技術人員熟知的常用於試劑盒中的實際，例如脫蠟、預固定處理、固定處理、蛋白酶消化進行透化、分級脫水、雜交等步驟中使用的試劑，例如二甲苯、70%乙醇、96%乙醇、99. 9%乙醇、磷酸鹽緩衝液PBS、蛋白酶K、5 X SSC緩衝液、I X SSC緩衝液、0. 2 X SSC、核固紅等。當miR-885_5p檢測呈強陽性結果時，肝癌樣品多為臨床分期II期的肝癌組織。當miR-885-5p檢測呈弱陽性或陰性結果時，肝癌樣品多為臨床分期III期的肝癌組織。因此通過對miR-885-5p進行檢測，可以區分肝癌樣品到底是臨床分期為II期的樣品，還是臨床分期為III期的樣本。確定肝癌樣品的臨床分期可以為患者隨後治療方案的選擇和患者預後判斷提供一定的幫助，有助於為患者制定個性化的治療方案，以提供更有針對性的治療方案。
圖I在臨床分期II期檢測結果中miR-885_5p主要在腫瘤細胞胞漿和胞核均高表達。圖2在臨床分期III檢測結果中miR-885_5p主要在腫瘤細胞胞漿和胞核均低表達。
圖3在臨床分期III檢測結果中miR-885-5p主要在腫瘤細胞胞漿和胞核中幾乎不表達。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細描述。實施例I樣本1、2、3均為肝癌組織切片，採用如下方法對肝癌組織樣品中的miR-885_5p進行檢測( I)脫蠟和水化，具體步驟如下①組織切片置於二甲苯I中浸泡5分鐘，·②組織切片置於二甲苯II浸泡5分鐘，③組織切片置於二甲苯III浸泡5分鐘，④組織切片置於99. 9%乙醇I中上下浸泡10下，⑤組織切片置於99. 9%乙醇II中上下浸泡10下，⑥組織切片置於99. 9%乙醇III浸泡5分鐘，⑦組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下，⑧組織切片置於96%乙醇II中浸泡5分鐘，⑨組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下⑩組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘，(2)組織切片置於磷酸鹽緩衝液中浸泡2-5分鐘。(3)孵育蛋白酶K，將100 μ I濃度為15μ g/ml的蛋白酶K滴加與組織切片表面，37°C孵育10分鐘。(4)用磷酸鹽緩衝液洗處理過的組織切片2次，每次五分鐘。(5)組織切片脫水，具體步驟如下①組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下，②組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘，③組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下，④組織切片置於96%乙醇II中浸泡I分鐘，⑤組織切片置於99. 9%乙醇I上下浸泡10下，⑥組織切片置於99. 9%乙醇II浸泡I分鐘。(6)探針與miR-885-5p的雜交，將雜交液(50nM) 100 μ I滴加在組織切片中，將其放入溼盒中，55°C孵育I小時。(7) SSC緩衝液洗組織切片，具體步驟如下①組織切片置於55°C的5 X SSC緩衝液浸泡5分鐘，②組織切片置於55°C的5 X SSC緩衝液浸泡5分鐘，③組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，④組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，⑤組織切片置於55°C的I X SSC緩衝液浸泡5分鐘，⑥組織切片置於55°C的O. 2X SSC緩衝液浸泡5分鐘。
(8)封閉液封閉，室溫靜置15分鐘。(9)滴加連有鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:800) 100 μ 1，室溫靜置I小時。(10) PBST緩衝液洗3次，每次5分鐘。(11) KTBT緩衝液洗2次，每次5分鐘。(12)去離子水洗2次，每次I分鐘。(13)核固紅IOOml滴加於組織切片上染核，室溫靜置10分鐘。(14)流水洗組織切片10分鐘。(15)脫水、透明，具體步驟如下
①組織切片置於70%乙醇中浸泡30秒，②70%乙醇中浸泡I分鐘，③組織切片置於96%乙醇中上下浸泡10下④組織切片置於96%乙醇中浸泡I分鐘，⑤組織切片置於99. 9%乙醇II上下浸泡10下，⑥組織切片置於99. 9%乙醇III浸泡I分鐘。⑦二甲苯II中浸泡5分鐘，⑧二甲苯I浸泡5分鐘。(16)樹脂封片、鏡檢。鏡檢時，切片中有明顯藍紫色顆粒為強陽性(如圖I);淺藍色顆粒為弱陽性(如圖2);無明顯藍紫色顆粒的為陰性(如圖3)。肝癌樣品I的鏡檢結果如圖I所示。由圖片結果可見肝癌樣品I的組織切片中miR-885-5p的表達程度較高，其中有明顯藍紫色顆粒，即miR-885_5p檢測呈強陽性結果，後經病理組織切片檢測結果證實該肝癌樣品I為臨床分期II期的肝癌組織。肝癌樣品2的鏡檢結果如圖2和圖3所示。由圖片可見該組織切片中miR-885-5p的表達程度較低，淺藍色顆粒的為miR-885-5p檢測弱陽性結果，後經病理組織切片檢測結果證實該肝癌樣品2為臨床分期III期的肝癌組織。肝癌樣品3的鏡檢結果如圖3所示。由圖片可見該組織切片中miR-885_5p的表達程度較低，無明顯藍紫色顆粒，為miR-885-5p檢測陰性結果，後經病理組織切片檢測結果證實該肝癌樣品3為臨床分期III期的肝癌組織。實施例2利用包含原位雜交探針的試劑盒對肝癌病例的分析收集肝癌組織樣品，根據臨床上對肝癌的診斷標準，通過肝癌病理組織切片對肝癌組織樣品進行分期，嚴格篩選得到臨床分期分別為I I期和I I I期的233例肝癌病例。病理組織切片判斷臨床分期分別為I I期和I I I期的具體標準為I期(TlNo Mo)I期肝癌為亞臨床期，其中經手術證實腫瘤為單個結節，直徑小於5cm者稱之為小肝癌；II期(T2No Mo):出現臨床症狀或體徵但無III期表現者；III期(T3 No Mo):有明顯惡液質、黃疸、腹水、或遠處轉移之一者。利用包含序列5，AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3，的原位雜交探針和其他常用的原位試劑，例如5XSSC緩衝液等的試劑盒，依照實施例I中所述的肝癌組織樣品的原位雜交檢測方法對這219例肝癌病例樣本中的miR-885-5p的含量進行原位雜交檢測。檢測過程中設置陽性對照、陰性對照和空白對照，其中，採用實施例I中所使用的肝癌樣品I作為陽性對照，已知的缺少靶mRNA的組織和細胞作為陰性對照，不添加經標記的核酸探針的檢測樣品作為空白對照。檢測結果表明miR-885_5p在肝癌組織中的表達隨著臨床分期的升高而降低，具體檢測如果如表I所示表lmiR-885-5p在肝癌腫瘤組織中表達情況的分析
權利要求
1.一種檢測miR-885-5p的雜交探針在製備用於判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途，其特徵在於雜交探針的序列為5』 AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3』。
2.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於所述的miR-885-5p雜交探針是經過標記的探針。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於所述的miR-885-5p雜交探針是經過地高辛標記的探針。
4.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於使用所述診斷試劑判斷原發性肝癌臨床分期的步驟如下 (1)脫蠟和水化，具體步驟如下 ①組織切片置於二甲苯I中浸泡5分鐘， ②組織切片置於二甲苯II浸泡5分鐘， ③組織切片置於二甲苯III浸泡5分鐘， ④組織切片置於99.9%乙醇I中上下浸泡10下， ⑤組織切片置於99.9%乙醇II中上下浸泡10下， ⑥組織切片置於99.9%乙醇III浸泡5分鐘， ⑦組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下， ⑧組織切片置於96%乙醇II中浸泡5分鐘， ⑨組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下 ⑩組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘， (2)組織切片置於磷酸鹽緩衝液中浸泡2-5分鐘； (3)孵育蛋白酶K，將100μ I濃度為15 μ g/ml的蛋白酶K滴加與組織切片表面，37°C孵育10分鐘； (4)用磷酸鹽緩衝液洗處理過的組織切片2次，每次五分鐘； (5)組織切片脫水，具體步驟如下 ①組織切片置於70%乙醇I中上下浸泡10下， ②組織切片置於70%乙醇II中浸泡5分鐘， ③組織切片置於96%乙醇I中上下浸泡10下， ④組織切片置於96%乙醇II中浸泡I分鐘， ⑤組織切片置於99.9%乙醇I上下浸泡10下， ⑥組織切片置於99.9%乙醇II浸泡I分鐘； (6)探針與miR-885-5p的雜交，將雜交液(50nM)100 μ I滴加在組織切片中，將其放入溼盒中，55°C孵育I小時； (7)SSC緩衝液洗組織切片，具體步驟如下 ①組織切片置於55°C的5XSSC緩衝液浸泡5分鐘 ②組織切片置於55°C的5XSSC緩衝液浸泡5分鐘， ③組織切片置於55°C的IX SSC緩衝液浸泡5分鐘 ④組織切片置於55°C的IX SSC緩衝液浸泡5分鐘， ⑤組織切片置於55°C的IX SSC緩衝液浸泡5分鐘， ⑥組織切片置於55°C的O.2X SSC緩衝液浸泡5分鐘；(8)封閉液封閉，室溫靜置15分鐘； (9)滴加連有鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:800)100 μ I,室溫靜置I小時； (10)PBST緩衝液洗3次，每次5分鐘。
(11)KTBT緩衝液洗2次，每次5分鐘。
(12)去離子水洗2次，每次I分鐘。
(13)核固紅IOOml滴加於組織切片上染核，室溫靜置10分鐘。
(14)流水洗組織切片10分鐘。
(15)脫水、透明，具體步驟如下 ①組織切片置於70%乙醇中浸泡30秒， ②70%乙醇中浸泡I分鐘， ③組織切片置於96%乙醇中上下浸泡10下， ④組織切片置於96%乙醇中浸泡I分鐘， ⑤組織切片置於99.9%乙醇II上下浸泡10下， ⑥組織切片置於99.9%乙醇III浸泡I分鐘； ⑦二甲苯II中浸泡5分鐘， ⑧二甲苯I浸泡5分鐘； (16)樹脂封片、鏡檢。
5.一種通過原位雜交技術判斷原發性肝癌臨床分期的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括權利要求1-3中任意一項權利要求所述的檢測miR-885-5p的雜交探針和原位雜交使用的其他常用試劑。
全文摘要
本發明公開了一種醫學診斷用方法，具體的說是一種通過檢測原發性肝細胞癌組織中miR-885-5p的表達量來判斷肝癌臨床分期的方法，該方法是通過原位雜交技術實現的，屬於臨床免疫診斷方法，特別是運用原位雜交方法檢測miR-885-5p從而判斷肝癌惡性程度的方法。具體的技術方案是通過探針與小RNA的結合以及抗原抗體反應和呈色反應，顯示細胞或組織中的miR-885-5p含量，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應的產物，從而能夠在細胞或組織原位確定miR-885-5p的含量。並且以此進一步判斷肝癌臨床分期的免疫檢測方法。本發明所載明的方法對肝癌的臨床診斷具有實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK102888453SQ20121022221
公開日2013年1月23日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者田亞平, 張竹紅 申請人:中國人民解放軍總醫院