新的轉運蛋白構建物和轉運蛋白貨物結合分子的製作方法

2023-09-18 18:00:25

專利名稱：新的轉運蛋白構建物和轉運蛋白貨物結合分子的製作方法
新的轉運蛋白構建物和轉運蛋白貨物結合分子本發明涉及新的通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的轉運蛋白構建物及其變體。本發明還涉及轉運蛋白貨物結合分子，特別是具有貨物部分的新的轉運蛋白構建物結合物，貨物部分例如蛋白質或肽、核酸、細胞毒性劑、有機分子等。此外，本發明公開了包括這些結合物的 (藥物)組合物和牽涉這樣的轉運蛋白構建物的治療方法和用途。使感興趣的物質，如核酸、蛋白質或細胞毒性劑，而且還有其它(治療上有用的) 化合物能夠從外部介質有效地轉移進組織或細胞，特別是轉移到細胞核的技術在生物技術領域相當受關注。這些技術可適於體外和體內運輸並翻譯核酸進細胞，並因此適於蛋白質或肽生產、適於基因表達調節、適於細胞毒性效應或凋亡效應的誘導、適於細胞內過程的分析以及適於運輸各種不同貨物進細胞(或細胞核)的影響的分析等。感興趣貨物從外部介質到組織或細胞的這種轉移的一個重要應用是基因治療，其中所述貨物通常是核酸或基因。管該技術在過去十年已顯示一些相當有前景的發展，但是基因轉移通常受限於基因轉移載體不能有效地將生物活性貨物轉移進將被治療的宿主的細胞質或細胞核而不影響宿主基因組或改變活性貨物的生物學性質。在這方面，已發展了幾項技術，以努力更有效地將例如核酸，如DNA或RNA，轉染進細胞。通過基因轉移的方法將核酸轉染進患者的細胞或組織是分子醫學的重要方法並在眾多疾病的治療和預防中起關鍵作用。基因轉移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化學的)方法如用磷酸鈣或 DEAE-葡聚糖共沉澱核酸，這是能使核酸穿透質膜然後進入細胞和/或細胞核的方法。然而，該技術遭受低轉移效率和高百分比細胞死亡的困擾。另外，由於其本身的性質，該方法局限於體外或離體方法，但不適用於體內情況。對於涉及體外電穿孔的方法同樣如此。體外電穿孔基於高壓電流的使用，使細胞膜變得可透過，以允許新的核酸，例如DNA或RNA引入細胞。然而，這樣的方法通常不適於體內。此外，該技術同樣遭受低轉移效率和高百分比細胞死亡的困擾。另外熟知的物理或物理化學方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射彈基因轉移。生物射彈基因轉移(也稱作生物射彈粒子轟擊)是在康奈爾大學開發的方法，其允許將遺傳物質引入組織或培養細胞。生物射彈基因轉移通常通過表面包被金屬的顆粒，如金或銀顆粒而完成，並通過使用基因槍將包括被吸附的DNA的這些金屬顆粒射進細胞。與上面所討論的相似，該方法局限於體外或離體方法，但通常不適用於體內情況。其它方法利用所謂的轉運分子的轉運能力。將在該上下文中使用的轉運分子通常可以被分為病毒載體，即轉運分子，其包括病毒元件(viral element)；以及非病毒載體。當今可利用的最成功的基因治療策略依賴於病毒載體，如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒和皰疹病毒。這些病毒載體通常應用對DNA和核酸具有強親和力的病毒相關物質的結合物。由於其感染性質，病毒或病毒載體具有非常高的轉染速率。以在轉染的細胞中不形成功能性感染顆粒的方式，基因修飾通常使用的病毒載體。然而，儘管有這個安全措施， 但是存在許多與涉及免疫原性、細胞毒性和插入誘變的病毒載體有關的問題。舉例來說，不能排除引入的治療上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危險，例如，由於可能的重組事件。另外，病毒結合物難於利用並通常在治療之前需要長期的製備(參考，例如，美國專利號 5，521，291)。儘管非病毒載體不象病毒載體一樣有效，但是已開發了許多非病毒載體以在基因治療中提供更安全的選擇。最常見的非病毒載體中的一些包括聚乙稀亞胺、樹狀聚體、殼聚糖、聚賴氨酸和基於肽的轉運蛋白系統，例如許多種類的肽，它們通常本性是陽離子的並能與核酸諸如質粒DNA通過靜電相互作用而相互作用。為了成功的輸送，非病毒載體，特別是基於肽的轉運系統必須能克服許多障礙。這樣的障礙包括在運輸期間貨物部分，例如DNA或其它化合物的保護，以及貨物部分在體內早期降解或代謝的預防。在核酸，如DNA和RNA分子的情況下，非病毒載體必須另外能特異性地輸送這些分子，以在靶細胞中有效表達基因。尤其是對於核酸，如DNA和RNA分子，非病毒載體目前必須克服4個障礙以達到成功地輸送基因(參考，例如 Martin et al. ,The AAPS Journal 2007 ；9 (I)Article 3)。非病毒載體必須能1)緊密地結合併保護核酸，2)它必須能靶向特異的細胞表面受體，3)非病毒載體必須能分裂內體膜，和4)它必須將核酸貨物輸送到核並允許編碼的蛋白質或肽序列的翻譯。這樣的非病毒載體，特別是基於肽的非病毒載體，相對於其它非病毒策略有利，因為它們一般而言能到達所有這4個目的，然而，關於不同的障礙具有不同的效率。舉例來說，富含鹼性殘基如賴氨酸和/或精氨酸的陽離子肽能有效地將核酸如 DNA濃縮成可以穩定於血清中的小的緊密的顆粒。此外，肽配體與多聚物/核酸複合物 (polyplex)的連接允許靶向特異受體和/或特異細胞類型。如上述的多聚物/核酸複合物或陽離子聚合物通常與帶負電荷的核酸形成複合物，所述複合物導致核酸的濃縮，並保護這些核酸免於降解。利用多聚物/核酸複合物(陽離子聚合物)向運細胞運輸通常通過受體介導的胞吞作用而發生。因此，通過例如結合到表面受體並觸發胞吞作用的多聚物/核酸複合物聚左旋賴氨酸(PLL)，將DNA偶聯到獨特的分子，如轉鐵蛋白。多聚物/核酸複合物(陽離子聚合物)包括例如聚左旋賴氨酸(PLL)、殼聚糖、聚乙稀亞胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate) (PD-MAEMA)、聚醯胺(PAMAM)。這樣的作用還從納米顆粒/核酸複合物(nanoplexes)(納米顆粒系統)或脂質/核酸複合物 (lipoplexes)(脂質體系統)得知。納米顆粒/核酸複合物(納米顆粒系統)通常包括聚丙烯酸酯、聚醯胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat) (PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂質/核酸複合物或脂質體系統通常包括能模擬細胞膜的陽離子脂質的使用。因此，脂質帶有正電荷的部分與核酸帶有負電荷的部分相互作用，並因而能夠與細胞膜融合。脂質/核酸複合物或脂質體系統包括，例如D0TMA、DOPE、D0SPA、DOTAP, DC-Cho 1、EDMPC 等。在該上下文中，受體介導的胞吞作用在實驗系統中同樣被廣泛利用，以向細胞靶內向輸送貨物如核酸或治療劑。在受體介導的胞吞作用期間，含有貨物的複合物被位於細胞膜中的對該貨物特異的受體或者位於細胞膜組分中的特異抗體選擇性地內在化。針對包括IgG Fe、生長抑素、胰島素、IGF-I和-II、轉鐵蛋白、EGF、GLP-I、VLDL或整合素受體等在內的許多受體，已經描述了胞吞作用活性。通過受體介導的胞吞作用，已經廣泛檢驗了不同的肽或蛋白質序列在基因轉移方法中的用途。令人驚奇地，通過噬菌體展示技術的應用，已經深深地推動了指導有效的受體介導的胞吞作用的肽序列的分離。噬菌體展示文庫是極其強大的工具，其為細胞受體提供分子變體的實際上無限的來源以及短肽，所述變體包括對天然配體或貨物部分的修飾。相似的文庫也已被直接注射進小鼠中，並且肽序列已被成功地分離，所述序列顯示對腦和腎的13倍的選擇性。前蛋白轉化酶可作為可用於將分子運輸至細胞的肽或蛋白質序列的例子。前蛋白轉化酶是細胞表面受體的例子，其通過受體介導的胞吞作用變得內在化。已經顯示，這些蛋白質是造成肽激素、神經肽和許多其它蛋白質的前體轉變成其生物學活性形式的原因。前蛋白轉化酶家族的所有切割位點遵從共有序列R-X-X-R。哺乳動物前蛋白轉化酶在其組織分布的基礎上可以分成三組。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/SPC7在廣泛範圍的組織和細胞系中表達。相反，PC2和PC1/PC3的表達限於神經內分泌組織，如胰島、垂體、腎上腺髓質和許多腦區域。PC4的表達高度局限於睪丸生精細胞。神經內分泌特異轉化酶——PC2和PC1/PC3主要位於分泌顆粒中。也已經報導PC5/PC6A位於分泌顆粒中。此外，間接的證據已經表明，一部分前蛋白轉化酶分子存在於細胞表面上，並且已經顯示，弗林蛋白酶在TGN和細胞表面之間循環。總之，這些性質表明，前蛋白轉化酶將細胞外配體運輸進細胞內間隙。所謂的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白轉導結構域(PTDs)也是有利的。來源於易位蛋白或蛋白轉導結構域(PTDs)的肽序列通常能在其酸性環境中選擇性地裂解內體膜，導致多聚物/核酸複合物的胞質釋放。易位蛋白被認為是能影響大分子在細胞(易位蛋白)之間轉運的一組肽，如HIV-I TAT(HIV)、觸角(果蠅屬(Drosophila)觸角)、 HSV VP22(單純皰疹)、FGF或乳鐵蛋白等。相反，蛋白轉導結構域(PTDs)被認為是能指導與這些序列共價結合的蛋白質和肽通過細胞膜進入細胞的一組肽(Leifert and Whitton Translocatory proteins and protein transduction domains :a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No. 1 2003)。易位蛋白共有的以及PTDs共有的是鹼性區，由於所述鹼性區能結合聚陰離子如核酸，其被認為是造成融和肽轉運的主要原因。利用受體依賴的非飽和吸附胞吞作用，在沒有結合到其上的情況下，PTDs可以發揮與陽離子轉染試劑相似的作用。當給予基於疫苗的肽時，為了實現或增強CTL應答，PTDs通常與蛋白質或肽偶聯(參考綜述Melikov and Chernomordik， Arginine-rich cell penetrating(poly-)peptides s :from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell.Mol.Life Sci·2005)。令人遺憾的是，由於肽酶，基於肽的轉運蛋白系統典型地在體內遭受蛋白質水解性降解，導致截短的轉運蛋白(和/或貨物)序列。可將這樣的肽酶區分為外肽酶和內肽酶，它們都是能通過被稱作蛋白水解的過程催化蛋白質分裂成較小的肽部分甚至分裂成單個胺基酸的酶。在該上下文中，內肽酶是典型地蛋白水解肽酶，其破壞非末端胺基酸(即分子內)的肽鍵。內肽酶對某些胺基酸是典型地特異的。內肽酶的例子包括例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶和內肽酶V等。已知胰蛋白酶在Arg或Lys之後切割，除非後面跟著ftx)。已知糜蛋白酶在Phe、Trp或Tyr之後切割，除非後面跟著ftx)。 糜蛋白酶在Asn、His、Met或Leu之後較慢地切割。彈性蛋白酶在Ala、Gly、Ser或Val之後切割，除非後面跟著1^0。嗜熱菌蛋白酶是一種熱穩定的內切蛋白酶，其在IleJetJhe、Trp, Tyr或Val之前切割，除非前面是ftx)。嗜熱菌蛋白酶有時在Ala、Asp、His或Thr之後切割。已知胃蛋白酶在Leu、Phe、Trp或Tyr之前切害I]，除非前面是ftx)。最後，已知內肽酶V8在Glu之後切割。與內肽酶不同，外肽酶是催化將胺基酸從多肽鏈的末端去除並因此切割所述多肽鏈末端的酶。可根據它們的切割位點將外肽酶區分為氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶是典型地鋅依賴性酶並由小腸的腺體產生。氨肽酶通常切割來自肽或蛋白質序列的氨基末端的單個胺基酸。羧肽酶是水解肽鍵的羧基末端(C末端)的典型的酶。人類、動物和植物含有幾種類型的具有範圍從分解代謝到蛋白質成熟的不同功能的羧肽酶，該酶是存在於胰液中的消化酶，將從肽的羧基端切割單個胺基酸。特定的例子是羧肽酶N(CPN)，由兩個具有酶活性的小亞基和兩個保護酶抵禦降解的大亞基組成的血漿鋅金屬蛋白酶。CPN切割來自生物學上有活性的肽諸如補體過敏毒素、激肽和血纖肽的羧基末端胺基酸精氨酸和賴氨酸。為了改變如上面所定義的基於肽的轉運蛋白系統的蛋白酶剪切，基於肽的轉運蛋白系統可完全由D-胺基酸組成，因此形成「逆反肽序列(retro-inverso peptide sequences) 術語「逆反(肽)序列」指線性肽序列的異構體，其中序列的方向是反向的， 每個胺基酸殘基的手性是顛倒的(參見例如Jameson et al.，Nature，368，744-746 (1994)； Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。組合D-對映體胺基酸和反向合成的優點是交換每個醯胺鍵的羰基和氨基的位置，而保持側鏈基團在每個α碳的位置。由於基於肽的轉運蛋白的肽序列天然存在的L-對映體胺基酸的構象改變為D-對映體胺基酸，體內蛋白酶剪切的危險消除了，這對貨物部分轉染進細胞的目的是有利的和高度有效的。相反，術語 「反向序列」指序列的方向是反向的序列(但是每個胺基酸殘基的手性不是顛倒的(例如D -Arg-L-Arg-L-Arg 一 L-Ar g-L-Ar g-D-Ar g)0然而，儘管作為如上面所定義的轉運蛋白分子有效地工作，但是這樣的基於肽的轉運蛋白的肽序列天然存在的L-對映體胺基酸的構象改變為D-對映體胺基酸使承擔在細胞的整個生命期間這些轉運蛋白在細胞中顯著積累或在更長時間裡這些轉運蛋白在(周圍)組織或器官中顯著積累的危險。因此，即使期間切割開或代謝連接的貨物部分，這樣的轉運蛋白仍可殘留在細胞中並參與進一步的細胞間和細胞內過程，導致未知的和不需要的副作用。因此，在本領域中需要提供可選的非病毒轉運蛋白分子，優選地是如上面所定義的基於肽的轉運蛋白系統，其避免在細胞或組織中這樣的不需要的積累但仍然允許貨物部分有效地轉移進細胞。如所附的權利要求書中所定義的主題，特別是如權利要求書中所定義的新的轉運蛋白構建物和其結合物(轉運蛋白貨物結合分子)解決了上面的目的。利用如權利要求書中所定義的新的轉運蛋白構建物和其結合物的方法和用途進一步解決了上面的目的。根據本發明的第一個方面，通過包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個序列的新型轉運蛋白構建物或由通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個序列組成的新型轉運蛋白構建物解決本發明的目的D1LLLxDm(LLLyDn)a其中D是D-胺基酸；L是L-胺基酸；
a是0-3，優選地0_2，更優選地0、1、2或3，甚至更優選地0、1或2，最優選地1 ；1、m和η相互獨立地是1或2，優選地1 ；χ和y相互獨立地是0、1或2，優選地1。如本文所用，術語「轉運蛋白構建物」指含有胺基酸的化合物，其能易位跨過生物膜。如本文所用，術語「運輸序列」(或轉運蛋白序列)指提供跨過生物膜易位的胺基酸序列。因此，根據本發明轉運蛋白構建物包括允許轉運蛋白構建物易位跨過生物膜的運輸序列。因此，根據通式(I)的新的轉運蛋白構建物有效地允許並可提供貨物部分，例如蛋白質或肽、核酸、小的有機分子、抗原、細胞毒性劑等，運輸進器官、組織、細胞(例如將被治療的)、細胞亞區室和/或細胞核。有利地，發明的根據通式(I)的轉運蛋白構建物足夠穩定以防止在將貨物部分運輸到其靶位之前被蛋白酶降解。另一方面，發明的根據通式(I)的轉運蛋白構建物不是永久地存在於細胞中，可在相當長的期限內被蛋白酶降解以避免不良副作用諸如新的發明轉運蛋白或其結合物在細胞中的不需要的積累。如本發明人所令人驚訝地發現，只有通過上面定義的通式(I)的發明模式(本文也被描述為D-/L-模式)，可將這樣的有益性質給予運輸序列，特別是在本領域已知的任何運輸序列，用如通式(I)中所定義的L-胺基酸的特定內容代替D-胺基酸的特定的內容和位置。該發明的D-/L-模式允許熟練的技術人員將如上面所定義的本發明新型轉運蛋白構建物在細胞中的體內或體外持久性足夠精確地定義為足夠長的時間，以保證在相當長的期限內本發明新型轉運蛋白構建物被蛋白酶降解之前本發明新型轉運蛋白構建物給予到和進入細胞或細胞核。該細胞中本發明新型轉運蛋白構建物的體內或體外持久性實際上依賴用如通式(I)中所定義的L-胺基酸的特定內容代替的D-胺基酸的特定內容和位置。此外，顯示發明的上面定義的通式(I)的D-/L-模式的轉運蛋白構建物足夠短以避免諸如下面定義的轉運蛋白貨物結合分子中本發明新型轉運蛋白構建物對貨物部分的空間位阻。它還允許這樣的本發明新型轉運蛋白構建物的有成本效益的製備。另外，可容易地形成上面定義的通式(I)的轉運蛋白肽或蛋白與蛋白質或肽、核酸諸如DNA和RNA分子或與細胞毒性劑或甚至小的有機分子等的結合物。根據上面定義的通式(I)，本發明新型轉運蛋白構建物包括根據如通式(I)所提出的特定D-/L-模式的L-胺基酸和D-胺基酸。在本發明的背景中，L-胺基酸，也稱作L-對映體胺基酸，優選地是選自天然存在的胺基酸或其衍生物的胺基酸。天然存在的胺基酸典型地選自標準的(蛋白原的)胺基酸丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸、以及選自非標準胺基酸諸如鳥氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、羥脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸、Y -氨基丁酸等。來自這樣的L-胺基酸或L-對映體胺基酸的衍生物典型地包括這些胺基酸的任何天然或非天然存在的衍生物，包括，但不限於如上所定義的胺基酸，其包括翻譯後修飾或合成修飾，包括乙醯化作用(在肽序列的N端，在賴氨酸殘基處等)、脫乙醯作用、烷化諸如甲基化、乙基化等(優選地在肽序列內的賴氨酸或精氨酸殘基處)、脫烷基化諸如脫甲基化、脫乙基作用等、醯胺化(優選地在肽序列的C端)、甲醯化、Y-羧化作用、穀氨醯化(glutamylation)、糖基化(優選地在肽序列內的天冬醯胺、賴氨酸、羥賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基處等)、血紅素或血紅素部分的加成、羥基化、碘化作用、類異戊二烯部分諸如法尼基或櫳牛兒基櫳牛兒醇(geranylgeraniol)等的異戊二烯化加成)、硫辛醯化 (Iipoylation)((硫辛酸官能團的連接)，諸如異戊二烯化、GPI錨的形成，包括豆蔻醯化、 法尼基化、櫳牛兒基忙櫳兒基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如對肽序列內的絲氨酸、酪氨酸(tytosine)、蘇氨酸或組氨酸部分等)、硫酸化作用(例如酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。L-胺基酸的衍生物也包括、但不限於修飾的L-胺基酸，其已經通過引入以下標記之一被修飾(i)放射性標記，即放射性磷酸化或帶有硫、氫、碳、氮等的放射性標記；(ii)彩色染料(例如，地高辛配基(digoxygenin)等)；(iii)螢光基團(例如，螢光素、羅丹明、如下面所定義的螢光染料蛋白等)；(iv)化學發光基團；(ν)根據(i)至(iv)所述的兩種或更多種標記的組合。L-胺基酸衍生物的尤其特別的例子包括、但不限於AMC (氨基甲基香豆素)、Dabcyl ( 二甲氨基苯基偶氮卞酉先(dimethylaminophenylazobenzoyl)) > Dansyl (二甲氨基萘磺醯(dimethylaminonaphtalenesulfonyl))、FAM(羧基螢光素 (carboxyfluoroscein)), Mca(甲氧基香豆素乙醯基)、Xan (咕噸基)、Abu (氨基丁酸)、 β -Ala ( β -丙氨酸)、E-Ahx (6-氨基己酸)、α -Aib ( α -氨基異丁酸)、Ams (氨基絲氨酸 (aminoserine))、Cha (環己胺)、Dab ( 二氨基丁酸)、Hse (高絲氨酸)、Hyp (羥脯氨酸)、 Mpr (巰基丙酸)、Nal萘丙氨酸(naphtylalanine) ,Nva (正纈氨酸)、0rn (鳥氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Sar (肌氨酸)、kc (硒代半胱氨酸)、Thi (噻吩丙氨酸)等。此外，針對如上面所定義的本發明新型轉運蛋白構建物選擇的L-對映體胺基酸可進一步選自上面定義的L-對映體胺基酸或其衍生物的特定組合。這樣的組合可包括1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個上面定義的L-對映體胺基酸或其衍生物。組合還可能是通式(I)或如本文所定義的任何子式的定義之內任何上面定義的L-對映體胺基酸或其衍生物和任何上面定義的D-對映體胺基酸或其衍生物之間。這樣的胺基酸的特定組合可顯示對肽酶的較高或較低的穩定性，因此可提供另外的可能性以提供如上面所定義的本發明新型轉運蛋白構建物對較高或較低穩定性的體內或體外穩定性。舉例來說，本發明新型轉運蛋白構建物可含有以D型和/或L型(即作為D-對映體胺基酸或作為L-對映體胺基酸或混合的D-和L-對映體胺基酸)，優選地以L型的二肽序列Arg-Lys，其顯示對肽酶的較低的穩定性，因此可用於使本發明新型轉運蛋白構建物的肽序列不穩定，因此進一步減少其體內半衰期。在本發明的上下文中，D-胺基酸，也被稱作D-對映體胺基酸，優選地是非天然的 (非蛋白原的)「逆反」胺基酸，其中這些非天然的(非蛋白原的)「逆反」胺基酸優選地衍生自如上面所定義的天然存在的L-胺基酸和/或它們的衍生物。在本文中，術語「逆反」 指如上面所定義的天然存在的L-胺基酸(和從此製備的肽)的異構體，其中天然存在的 L-胺基酸殘基的手性在相應的D-胺基酸中是反向的(參見，例如Jameson et al. ,Nature, 368,744-746(1994) ；Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。換言之，在 D-胺基酸的肽鍵中，羰基和氨基基團的位置被調換，同時在每一個α碳，側鏈的位置是保留的。因此，D-胺基酸可被插入到由L-胺基酸組成或包括L-胺基酸的肽序列中，因此可通過本領域已知的方法將D-胺基酸與如上面所定義的L-胺基酸結合。本領域已知的這樣的方法包括，例如，但不限於液相肽合成方法或固體肽合成方法，例如根據Merrifield的固體肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基於BOP (苯並三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)_磷六氟磷酸鹽)的固相肽合成等。根據上面的通式(I)的D-/L-模式，D-胺基酸在本發明新型轉運蛋白構建物中的含量另外提供許多種有用的性質。例如，這樣的新的轉運蛋白構建物更有效地進入細胞並是更穩定(尤其是體內)並顯示較相應的基於L-胺基酸序列的轉運蛋白構建物較低的免疫原性。然而，它們不象完全由D-胺基酸製備的轉運蛋白構建物在細胞中是持久的，特別是由於幾乎所有的分解酶，象蛋白酶或肽酶，在相鄰的 L-胺基酸之間切割肽鍵的事實。所以，由D-對映體胺基酸和L-對映體胺基酸組成的肽在很大程度上抵抗快速蛋白水解分解，而不導致由於缺少蛋白酶的降解而在細胞中積累。上面定義的根據通式(I)的本發明新型轉運蛋白構建物，優選地包括如上面所定義的L-胺基酸和D-胺基酸或它們的衍生物。這樣的衍生物可以以約0%、約10%、約20%、 約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %或甚至約100 %的含量包含在整個本發明新型轉運蛋白構建物中。換言之，整個本發明轉運蛋白肽可含有約1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和更多個這樣的衍生物，其中可能的衍生物的最大數目當然受限於包含在上面定義的根據通式(I)的本發明新型轉運蛋白構建物的胺基酸的最大數目。根據上面定義的通式(I)，本發明新型轉運蛋白構建物包括L-胺基酸和D-胺基酸的特定的D-/L-模式，其由整數a、1、m、η、χ和y限定。根據通式(I)的上面的定義，a是限定如通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a中所定義的亞組(LLLyD)的重複數的決定因子。根據上面的定義，a可以是選自0-3，優選地選自0_2，更優選地選自10-1的任何數，或可選自單個數0、1、2或3，更優選地選自單個數0、1或2，最優選地a = 1。根據a = 0、1、2或3的特定的重複數，根據通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的本發明新型轉運蛋白構建物可由以下子式(Ia)至(Id)的至少之一組成或包括以下子式(Ia) 至(Id)的至少之一(Ia) =D1LLLxDm (SEQ ID NO 2)；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn (SEQ ID NO 3)；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO 4)或(Id) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO :5)。此外，根據通式(I)的上面的定義，l、m和η是限定出現在如本文所定義的通式 (I)和子式(Ia)至(Id)中的D-胺基酸數的整數。整數l、m和η可相互獨立地選擇。這對於決定因子η特別如此，其可在如本文所定義的通式(I)或子式(Ia)至(Id)中出現幾次，即如果η出現幾次，每個η可相互獨立地選擇。根據上面的定義，整數1、m和η相互獨立地可以是選自1-2的任何數，或可選自單個數1或2，更優選地1、m和/或η = 1。另外，根據通式(I)的上面的定義，χ和y是限定出現在如本文所定義的通式(I) 和子式(Ia)至(Id)中的L-胺基酸數的整數。整數χ和y可相互獨立地選擇。根據上面的定義，整數χ和y相互獨立地可以是選自0-2的任何數，優選地選自0-1，或可選自單個數 0、1或2，更優選地選自單個數1或2，最優選地x和/或y = 1。
根據一個特別優選的實施方式，本發明的目的通過包括特定子式(Ie)的至少一個序列或由特定子式(Ie)的至少一個序列組成的新型轉運蛋白構建物解決DLLLD (LLLD)a(SEQ ID NO 6)；其中D、L和a是如上面針對通式⑴或子式(Ia)至(Id)所定義的。根據另一個特別優選的實施方式，本發明的目的通過包括特定子式(If)的至少一個序列或由特定子式(If)的至少一個序列組成的新型轉運蛋白構建物解決DLLLDLLLD(SEQ ID NO 7)；其中D和L是如上面針對通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定義的。根據通式(I)或根據任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本發明新型轉運蛋白構建物，特別地是包括新的D-/L-模式轉運蛋白構建物，可與本領域已知的任何運輸序列一起使用或應用於本領域已知的任何運輸序列，其中那些運輸序列的鄰接的(連續的)胺基酸的選擇數目通過如通式⑴或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If) 所定義的胺基酸數目確定。這樣的運輸序列典型地指導貨物部分運輸進細胞或細胞核或另外的特定靶區並可包括，但不限於，如上面所定義的易位蛋白，例如衍生自HIVTAT (HIV)，例如天然蛋白諸如例如TAT蛋白(例如美國專利號5，804，604和5，674，980中所描述的，這些參考文獻中的每個通過引用被併入本文)，例如衍生自HIV tat (HIV) ,HSV VP22 (單純皰疹)(在例如 WO 97/05265 ；Elliott and 0' Hare, Cell 88 :223-233(1997)中被描述)、 非病毒蛋白(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10691-10695 (1992))，運輸序列，其衍生自觸角足，特別是衍生自果蠅屬觸角(例如其觸角載體序列)、FGF、乳鐵蛋白等， 或衍生自鹼性肽，例如具有長度為5至15個胺基酸，優選地10至12個胺基酸，並包括至少 80%，更優選地85%或甚至90%的鹼性胺基酸，諸如例如精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的肽，或可選自例如富含精氨酸的肽序列，諸如I 9、R8、R7、R6、R5等，衍生VP22，衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽，衍生自RGD-K16,衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽，衍生自SynB3 或SynB3衍生的蛋白或肽，衍生自PC抑制劑，衍生自P21衍生的蛋白或肽，或衍生自JNKI 衍生的蛋白或肽。此外，在此公開了用作運輸序列的天然蛋白之一的變體、片段和衍生物。形成如上面所定義的根據通式(I)或任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或 (If)的新的轉運蛋白構建物基礎的運輸序列的特定例子可選自，但不限於所謂的TAT細胞滲透序列，其衍生自HIV-I TAT蛋白的鹼性運輸序列。優選地，HIV-I TAT蛋白的鹼性運輸序列可包括來自人免疫缺陷病毒HIV-I TAT蛋白的序列，例如如在例如通過引用被併入本文的美國專利號5，804，604和5，674，980中所描述的。在該上下文中，全長HIV-I TAT蛋白具有由HIV TAT基因的兩個外顯子編碼的86個胺基酸殘基[SEQ ID NO :8]。TAT胺基酸 1-72由外顯子1編碼，而胺基酸73-86由外顯子2編碼。全長TAT蛋白被表徵為含有兩個賴氨酸和六個精氨酸(胺基酸49-57)的鹼性區和含有七個半胱氨酸殘基(胺基酸22-37)的富含半胱氨酸區。鹼性區(即胺基酸49-57)被認為對核定位是重要的。Ruben，S.et al.， J. Virol. 63 :1-8(1989) ；Hauber, J. et al.，J. Virol. 631181-1187 (1989)。富含半胱氨酸區介導體外金屬連接的二聚體的形成(Franke 1, A. D. et al, Science 240:70-73(1988)； Frankel，A.D· et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 :6297-6300(1988))並它作為對反式作用子的活性是必需的(Garcia, J. A. et al.，EMBO J. 7 :3143(1988) ；Sadaie, Μ. R. et al.， J. Virol. 63 :1 (1989))。如在其它調節蛋白中，N端區可參與防護細胞內蛋白酶(Bachmair，A.et al. ,Cell 56:1019-1032(1989))。利用通式(I)或子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie) 或(If)的任何一個的優選的TAT運輸序列，優選地被表徵為TAT鹼性區胺基酸序列(天然存在的tat蛋白的胺基酸49-57)的存在；TAT富含半胱氨酸區胺基酸序列(天然存在的TAT 蛋白的胺基酸22-36)的缺失和TAT外顯子2編碼的羧基端結構域(天然存在的TAT蛋白的胺基酸73-86)的缺失。根據更優選的實施方式，形成如上面所定義的根據通式(I)或任何子式(Ia)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的轉運蛋白構建物基礎的運輸序列可選自含有TAT殘基48-57或49至57的胺基酸序列，最優選地是根據SEQ ID NOs 8至14任何一個的TAT 序歹丨J，或選自通用 TAT 序歹Ij NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-C00H (L 類 TAT (s)) [SEQ ID NO 16]和 /或XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L類TAT) [SEQ ID NO: 15]。在該上下文中，每個X典型地代表這樣的胺基酸殘基，其優選地選自如本文所定義的任何(天然存在的)胺基酸殘基。此外，每個Xnb可選自任何如本文所定義的胺基酸殘基，其中n(X的重複數)是0-5、5-10、 10-15、15-20、20-30或更多。優選地，Xnb代表衍生自根據SEQ ID NO 8 (TAT (1-86))的序列的一段連續肽殘基。可選地，形成如上面所定義的根據通式(I)或任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的轉運蛋白構建物基礎的運輸序列可選自，例如， 含有胺基酸序列 NH2-GRKKRRQRRR-C00H(L-TAT (sla)) [SEQ ID NO 17]或胺基酸序列 NH2-RKKRRQRRR-C00H(L-TAT(slb)) [SEQ ID NO :18]的肽。本領域的技術人員將理解這樣的短語，象根據通式(I)或根據任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的序列可與特定的(運輸)序列一起使用或應用於特定的 (運輸)序列，或可形成通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)等的轉運蛋白肽構建物的基礎，旨在舉例說明請求保護一個序列，其顯示關於以下的某些特徵i)表徵特定胺基酸實體的側鏈殘基序列，和ii)所述的序列中的D和L胺基酸的序列。為了給出示例性的例子如果子式(If)與TAT (1-86) (SEQ ID NO 8) 一起使用或應用於TAT(l-86) (SEQ ID NO :8)，那麼側鏈殘基的序列⑴如SEQ ID NO :8中所顯示。然而，該請求保護的序列不是純的L-胺基酸序列，而是某處包括子式(If)的基序。這樣的實施方式的例子將是以下序列(以小寫字母表示的D-胺基酸，以大寫字母表示的L胺基酸)MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGrK KRrQRRrPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKEo由於SEQ ID NO 8包括86個胺基酸，所以當然存在將子式(If)的基序放在該序列中別處的幾個另外的可能性。還可想像在特別的實施方式中該序列可包括通式和/或子式一個以上的基序。形成如上面所定義的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的轉運蛋白構建物基礎的運輸序列的特別優選的例子可選自，但不限於，根據以下表1所定義的序列或其部分，或其任何片段或變體或衍生物(只要它保留跨過生物膜易位的功能)。表 權利要求
1.轉運蛋白構建物，其包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個序列 D1LLLxDm(LLLyDn)a 其中D是D-胺基酸； L是L-胺基酸； a 是 0-3 ；1.m和η相互獨立地是1或2； χ和y相互獨立地是0、1或2。
2.根據權利要求1的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括根據以下子式 (Ia)至(Id) (SEQ ID NOs :2至5)之一的至少一個序列(Ia) =D1LLLxDm ；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn ；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn ；或(I d) D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn。
3.根據權利要求1或2的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括根據以下子式(Ie) (SEQ ID NO 6)的至少一個序列DLLLD(LLLD)a。
4.根據權利要求1、2或3中任一項的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括根據以下子式(If) (SEQ ID NO 7)的至少一個序列DLLLDLLLD。
5.根據權利要求1-4中任一項的轉運蛋白構建物，其中將根據通式(I)或根據任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列與運輸序列一起使用，或應用於運輸序列，所述運輸序列衍生自HIV-I TAT蛋白(SEQ ID NO 8)；優選衍生自含有HIV-1 TAT 蛋白(SEQ ID NO 8)的TAT殘基48-57或49至57的胺基酸序列；或衍生自HSV VP22 (單純皰疹(Herpes simplex))；或衍生自觸角足載體序列(果蠅屬觸角足(Drosophila antermapedia))、FGF、乳鐵蛋白；或衍生自鹼性的肽，該肽的長度為5至15個胺基酸，優選地10至12個胺基酸，並包括至少80 %，更優選地85 %或甚至90 %的選自精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的鹼性胺基酸，或可選自富含精氨酸的肽序列，包括&、R8> r7、R6> R5 ；衍生自 VP22 ；衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽；衍生自RGD-Kni ；衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽；衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽；衍生自PC抑制劑；衍生自P21衍生的蛋白或肽；衍生自JNKI衍生的蛋白或肽；或衍生自這些運輸序列之一的變體、片段和衍生物。
6.根據權利要求1至5中任一項的轉運蛋白構建物，其中將根據通式(I)或根據任何子式(la)、(lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的所述序列與以下序列之一或其反向序列或這些序列的變體或片段一起使用，或應用於下序列之一或其反向序列或這些序列的變體或片段
7.根據權利要求1至6中任一項的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括根據rXXXrXXXr (SEQ ID NO :252)的至少一個序列，其中R代表D-對映體精氨酸； X是任何L-胺基酸；其中每個X可單獨地並獨立於SEQ ID NO 252內的任何其它X而選擇。
8.根據權利要求8的轉運蛋白構建物，其中所述6個XL-胺基酸的至少4個單獨地選自由K或R組成的L胺基酸。
9.根據權利要求1至8中任一項的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，並且其中所述轉運蛋白序列選自以下序列
10.根據權利要求1至9中任一項的轉運蛋白構建物，其中所述轉運蛋白構建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，並且其中將所述轉運蛋白序列與運輸序列一起使用或應用於運輸序列，所述運輸序列衍生自HIV-I TAT蛋白，在所述TAT衍生的序列的位置2 具有酪氨酸(Y)，所述序列優選地選自序列TAT(s2-91) (SEQ ID NO :116)。
11.根據權利要求5至10中任一項的轉運蛋白構建物，其中將根據通式(I)或根據任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述轉運蛋白序列與權利要求5至10中列出的任何所述運輸序列的變體或片段一起使用或應用於權利要求5至10中列出的任何所述運輸序列的變體或片段，其具有權利要求5至10中列出的任何所述運輸序列全長的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或85 %，優選地至少90 %，更優選地至少 95%和最優選地至少99%。
12.轉運蛋白貨物結合分子，其包括a)組分(A)，其中組分(A)包括根據權利要求1至11任一項的所述轉運蛋白構建物；和b)組分(B)，其包括效應分子。
13.根據權利要求12的轉運蛋白貨物結合分子，其中所述效應分子選自在治療上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制劑、蛋白激酶c-Jum氨基末端激酶的抑制劑、抗原、抗體、凋亡因子、病理狀態中牽涉的蛋白酶，優選地是肽蛋白酶抑制劑、BH3結構域或唯BH3蛋白、編碼這些蛋白的核酸、siRNAs、反義RNAs、細胞毒性劑和包括蛋白酶抑制劑的小有機化合物。
14.根據權利要求12或13的轉運蛋白貨物結合分子，此外包括至少一個不同於組分 ⑶的另外的組分(C)、⑶和/或(E)，其中所述至少一個任選的另外的組分(C)、⑶和/ 或(E)相互獨立地選自如針對組分(B)所定義的不同的效應分子或它們的片段或變體。
15.根據權利要求12至14中任一項的轉運蛋白貨物結合分子，其中組分(A)和(B)與任選的組分(C)、⑶和/或(E)相互共價連接。
16.根據權利要求12至15中任一項的轉運蛋白貨物結合分子，其中所述至少一個另外的組分(C)、(D)和/或(E)選自信號序列或定位序列，其引導所述發明的轉運蛋白貨物結合分子到特定的細胞內靶定位或到特定的細胞類型。
17.根據權利要求12至16中任一項的轉運蛋白貨物結合分子，其中組分(B)和/或所述至少一個另外的組分(C)、⑶和/或(E)是蛋白或肽序列並由L-胺基酸、D-胺基酸或二者的混合物組成。
18.根據權利要求12至17中任一項的轉運蛋白貨物結合分子，其中組分(A)位於所述轉運蛋白貨物結合分子的所述C末端，假設組分(B)是蛋白或肽序列。
19.根據權利要求12至18中任一項的轉運蛋白貨物結合分子，其用作藥物。
20.藥物組合物，其包括根據權利要求12至19中任一項的轉運蛋白貨物結合分子和任選地藥學上可接受的載體/或賦形劑。
21.根據權利要求1至11中任一項的轉運蛋白構建物用於製備轉運蛋白貨物結合分子的用途。
22.根據權利要求21的轉運蛋白構建物的用途，其中所述轉運蛋白貨物結合分子是如根據權利要求12至18中任一項所定義的。
23.根據權利要求1至11中任一項的轉運蛋白構建物或根據權利要求12至18中任一項所定義的轉運蛋白貨物結合分子用於將貨物分子轉運進將被治療的患者的細胞或組織的用途。
24.根據權利要求23的用途，其中所述貨物是如根據權利要求12至18中任一項所定義的。
25.根據權利要求23或M的用途，其用於將貨物分子轉運進白細胞和/或神經元細胞，特別是將被治療的患者的白細胞和/或神經元細胞。
26.根據權利要求12至18中一項的轉運蛋白貨物結合分子用於製備藥物的用途，該藥物用於預防、治療和/或改善癌症或腫瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、與NJK信號傳導密切相關的疾病、自身免疫性病症或疾病、心血管疾病、神經元或神經變性疾病、肝病、脊柱疾病、子宮疾病、重度抑鬱症、非慢性或慢性炎性消化病、聽力喪失、內耳疾病，或用在組織移植中。
全文摘要
本發明涉及通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的新轉運蛋白構建物和其變體。本發明還涉及轉運蛋白貨物結合分子，特別是所述新轉運蛋白構建物與貨物部分的結合物，貨物部分例如蛋白或肽、核酸、細胞毒性劑、有機分子等。此外，本發明公開了包括這些結合物的(藥物)組合物和涉及這樣的轉運蛋白構建物的治療方法和用途。
文檔編號A61K47/48GK102256998SQ200980151845
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月22日 優先權日2008年12月22日
發明者C·邦尼 申請人:希根有限責任公司