一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法
2023-06-18 16:14:46
專利名稱：一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，涉及牛冷凍精液精子質量評定技術，尤其涉及ー種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法。
背景技術：
家畜精液的冷凍保存是20世紀以來隨著人工授精技術的廣泛應用而產生，通過超低溫降低或抑制精子新陳代謝的速度，使精子生命在相對靜止的狀態下保存起來，以延長體外存活的時間。精液冷凍保存技術的應用不僅解決了精液長期保存的問題、便於開展國內外合作與交流，降低人工授精的成本，而且有利於高效利用優秀種公畜的遺傳資源，加快遺傳進展，加速品種改良，提高家畜的繁殖效率。人工授精技術作為養牛業應用最為廣泛的技術之一，雖然目前已經取得了良好效果，但一般的研究僅僅涉及不同稀釋液對精液冷凍質量的影響，探求適宜的冷凍稀釋液配方。關於稀釋液中不同成分提高精子活力的機理，影響精子凍後活力的相關基因、蛋白及其相互作用和表達的信號途徑等相對研究較少，由於對其作用機理不甚清楚，從而影響精液品質的進ー步提高。
發明內容
針對上述現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的目的在於建立一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法。該提取方法探索最優精液細管數與裂解液搭配比例，從而提高精子蛋白的濃度。實現上述發明目 的的技術方案是，一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，包括下列步驟:
1)將冷凍精液解凍後轉移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；
2)加入Iml預冷到4°C的PBS洗滌，在4で、1000 X g條件下離心5 min，重複3次；
3)向上述沉澱中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA組織/細胞裂解液)，用渦旋儀(2800 r/min)渦旋混勻，使樣品充分溶解；
4)靜置5min後，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。本發明從牛冷凍精子中提取蛋白的提取主要由三個步驟組成，分別是精子的洗滌、精子蛋白的提取和SDS-PAGE精子蛋白的分離，並以HSP90蛋白表達量與牛精子抗凍性關係為例說明精子蛋白濃度達到後續試驗要求的水平。假陰道法採集9頭牛的精液，測定新鮮精液指標(活力、形態、活率和密度)。精液樣品經過冷凍-解凍後檢測其品質，並按照凍後精子活力和質膜完整性進行分組，提取精子蛋白進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，經Western blot分析，以驗證HSP90含量與精子抗凍性的關係。SDS-PAGE電泳顯示，不同質量精子蛋白樣品中，90 kDa蛋白表達量差異顯著(P < 0.05)。Western blot分析驗證該蛋白為HSP90，HSP90蛋白的表達量與冷凍-解凍後的牛精子品質具有明顯的相關性。此結果表明:通過HSP90的Western blot可以預測不同精子的抗凍性,冷凍-解凍後,精子中HSP90表達量越高精子凍後活力越高，而HSP90表達量越低，其精子凍後活力越低。本發明為將來從分子手段研究精子冷凍保護機理奠定了基礎，可以進ー步提升精子冷凍後的活力。
圖1為精子蛋白SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍染色圖譜。圖2為HSP90蛋白的表達圖譜。下面結合發明人給的具體試驗數據和使用方法，進步ー步說明本發明的顯著效果。實施例1
1)將冷凍精液解凍後轉移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；
2)加入Iml預冷到4 0C的PBS洗滌，在4 V、1000 X g條件下離心5 min,重複3次； 3)向上述沉澱中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA組織/細胞裂解液)，用渦旋儀(2800 r/min)渦旋混勻，使樣品充分溶解；
4)靜置5min後，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。試驗例I以HSP90蛋白表達量與牛精子抗凍性關係進行說明
1.SDS-PAGE精子蛋白的分離
蛋白與SDS-PAGE上樣緩衝液混勻後，在95で煮5 min，取20 W蛋白樣品進行電泳。電泳結束後利用考馬斯亮藍染色，最後用BIO-RAD凝膠成像分析儀對凝膠進行拍照，並用Image Lab軟體對蛋白圖譜進行分析。本發明探索了不同冷凍精液細管數與蛋白裂解液之間的搭配比例，實驗結果表明本搭配可以較為徹底地裂解精子細胞，並使精子蛋白濃度達到較高的水平，可以進行後續的試驗和分析。圖1.精子蛋白SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍染色圖譜:a 2隻細管裂解於200 W裂解液中，b 3隻細管裂解於200 W裂解液中，c 4隻細管裂解於200 W裂解液中，d 4隻細管裂解於150 W裂解液中。可以看出，4隻細管裂解於200 W裂解液時，蛋白濃度最高。2.精液的採集與冷凍
用假陰道法採集種公牛精液，測定射精量後立即保存在37で水浴鍋中。同時在光學顯微鏡下進行精液常規品質檢查，光密度法測定精子密度。將新鮮精液經過品質評定後，對於合格精液用商用冷凍稀釋液進行稀釋，井分裝到聚氯こ烯(PVC)管(0.25 ml)中。冷凍時，首先使用程序冷凍儀，經過1.5 h，將細管精液從37で冷卻到4で，接著在4で條件下平衡2.5 h，然後將細管冷凍架置於裝有液氮的冷凍箱內，並將細管置於距液氮面2 3 cm處，燻蒸8 10 min，最後浸入液氮中保存。3.精液解凍
將冷凍細管從液氮罐中迅速取出後，立即投入37で水浴鍋中解凍40 S。所有用於精液品質鑑定或蛋白表達檢測的精子均在同一時間進行解凍，以保持樣本處理的一致性。4.精液品質檢測
I)精子活率評定對於每ー個樣品，毎次解凍3支細管凍精，以檢測精液品質。採用主觀目測法評定精子活率。細管精液溶解後立即取10沿精液滴到乾淨載玻片上，蓋上蓋玻片後在400 X光學顯微鏡下評定直線運動精子的百分率。毎次至少檢查300個精子，重複3次。2)精子質膜完整性測定將50 W精液稀釋於I ml果糖檸檬酸鈉低滲液中，在37で條件下孵育60 min。取15 W混合均勻的精液懸滴於載玻片上，在400X光學顯微鏡上觀察，統計尾巴彎曲的精子的百分率。每次至少檢查300個精子，重複3次。3)精子頂體完整性檢測細管精液解凍後，轉移至離心管中，800Xg離心3 min，棄掉上清液。用37で緩衝液調整密度，然後吸取30沿精子懸液塗片，乾燥後，用甲醇固定，接著加入30 W FITC-PNA染液，37°C避光潮溼環境下，用緩衝液衝洗，乾燥後封片，400 X螢光顯微鏡下觀察，並至少計數300個精子中頂體完整的精子數量，統計頂體完整精子的百分率。每個樣品重複3次。5.試驗設計
將9頭牛的精液按照完全相同的方式進行冷凍處理，解凍後檢測精子活率、質膜完整性和頂體完整性，根據精子活率和質膜完整性統計分析結果，將其分為兩組:HFR (Highfreezing resistance teams,冷凍-解凍後精子活率高於 40%)和 LFR (Low freezingresistance teams,冷凍-解凍後精子活率低於40%),並且兩組之間統計分析結果達到差異顯著的水平(P<0.05)。另外，在分組時舍掉活力居中的ー種精液，每組各包含4個不同牛個體的精液樣品，以保持兩組精液樣品量的一致性。根據分組結果，從剩餘的8種精液樣品中提取精子蛋白，進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和Western blot分析。整個試驗重複3次。6.Western blot 分析
SDS-PAGE結束後，採用半乾 法(18 v,45 min)將蛋白轉移至NC膜，並將膜置於含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉30 min，與HSP90或P-action—抗4で孵育過夜，然後用辣根過氧化物標記的ニ抗繼續孵育I h。最後與ECL試劑反應5 min。7.評定結果
I) Western blot 結果，見圖 2。2)冷凍-解凍牛精子活率、質膜完整性和頂體完整率
冷凍-解凍牛精子活率、質膜完整性和頂體完整率見表I。從表I可以看出，不同牛個體間凍後精液品質相差較大，其中精液樣品1、2、3、6組凍後精子活率偏低，低於40%，而精液樣品5、7、8、9組凍後精子活率較高，最高達到52.7%，精液樣品4的精子活率居兩者之間，為41.5%。據此，將9種精液樣品根據凍後平均精子活率和質膜完整性分為兩組，精液樣品
5、7、8和9分為HFR (High freezing resistance teams)組,其平均凍後精子活率和質膜完整性大於40% ;精液樣品1、2、3和6分為LFR (Low freezing resistance teams)組,平均凍後精子活率和質膜完整性均小於40%。為了平衡兩組精液樣品數量，保持後續測定精子蛋白時兩組精液樣品量的一致性，將精液樣品4略棹。統計分析表明，HFR組精子各項指標顯著高於LFR組精子(P < 0.05)，達到後續試驗分析的要求，見表2。表I冷凍-解凍後牛精子活率、質膜完整性和頂體完整率
幕W品I精子活率(%) I質膜完整性(%) I頂體完整性
135.1±0.2° 37.3±0.9° 33.7±4.1°
2[39- 8±0.1b [41.3 + 2.1ab [40.3 + 2.1bc
權利要求
1.ー種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特徵在於，包括下列步驟:1)將冷凍精液解凍後轉移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；2)加入Iml預冷到4 0C的PBS洗滌，在4 V、1000 X g條件下離心5 min,重複3次； 3)向上述沉澱中加200 W蛋白裂解液，渦旋混勻，使樣品充分溶解；4)靜置5 min後，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特徵在於，所述的蛋白裂解液是solarbio RIPA組織/細胞裂解液。
3.根據權利要求1所述的從 牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特徵在於，所述的渦旋的轉速是2800 r/min。
全文摘要
本發明公開了一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，包括以下步驟將冷凍精液解凍後轉移到離心管中，在4℃、1000×g條件下離心5min，棄上清液；2)加入1ml預冷到4℃的PBS洗滌，在4℃、1000×g條件下離心5min，重複3次；3)向上述沉澱中加200μl蛋白裂解液，渦旋，使樣品充分溶解；4)靜置5min後，在4℃、12000×g條件下離心30min，上清即為精子蛋白溶液。本發明從牛冷凍精子中提取蛋白的方法操作簡單，為將來從分子手段研究精子冷凍保護機理奠定了基礎，可以進一步提升精子冷凍後的活力。
文檔編號C07K1/14GK103113454SQ20131002902
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優先權日2012年4月12日
發明者胡建宏, 王紅, 李青旺, 王鵬, 洪潔贇, 王豔風, 侯放亮, 馬國際, 賈永宏 申請人:西北農林科技大學