一種微囊藻毒素mc-rr快速檢測試劑盒的製作方法

2023-06-19 08:05:06

專利名稱：一種微囊藻毒素mc-rr快速檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種微囊藻毒素MC-RR的快速檢測試劑盒，屬於生物技術領域。
背景技術：
微囊藻毒素(Microcystin，簡稱MC)是藍藻產生的一類天然毒素。而科學家的研 究表明，被微囊藻毒素汙染的飲用水和水產品，給人類健康帶來了巨大威脅。微囊藻是一類 卑微的生物，但它們有時會表現出超乎尋常的生命力。不論常規的自來水處理工藝，還是將 水煮沸，都難以有效去除微囊藻毒素。研究顯示，即使在300攝氏度高溫下微囊藻毒素仍然 可以保留一部分活性。微囊藻毒素在我國存在最普遍，含量相對較多的是MC-LR和MC-RR，其中L、R分別 代表亮氨酸、精氨酸。微囊藻毒素MC-RR，是一類具生物活性的單環七肽，其化學結構式，如 圖1所示。微囊藻毒素水華的頻繁暴發嚴重威脅著生態安全和人類的飲水安全，對水中微 囊藻毒素及時準確的監測非常重要。目前對水體中微囊藻毒素檢測技術的研究開發非常 活躍，主要有高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、酶聯免 疫吸附試驗(Emzyme-Linkde Immunosorbent Assay, ELISA)以及蛋白磷酸酶酶抑制試驗 (Protein Phosphatase Inhibition Assay, PPIA)等。常規的理化檢測方法，特別是液相色譜和質譜分析設備體積龐大、價格昂貴、需要 環境條件較高的室內環境、而且還需要專門的技術人員操作、前處理複雜、檢測費用昂貴； 並且由於微囊藻毒素異構體眾多，且性質近似，缺少相應標準品，成為微囊藻毒素大規模篩 查的限制條件。而磷酸酶酶抑制試驗雖然都能很好地檢測出毒素，但是存在靈敏度不高或 檢測過程繁瑣，樣品能量小等不足。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是基於抗原一抗體特異性 反應的分析方法，具有檢測特異性強、靈敏度高、分析能量大、檢測速度快、費用低廉等優 點，而且能適應大規模樣品的快速篩查和預警監測而被人們所重視和採用。酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)是將酶的催 化反應與抗原抗體的免疫學反應結合起來的一種檢測技術。由於抗原、抗體反應的高度專 一性，加之酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，因此能使測定方法達到很高 的特異性和靈敏度。ELISA方法作為體外診斷及科學研究的手段，集中了抗原抗體反應的特 異性和酶促反應的放大作用，理想的底物顯示信號使其結果的判讀更為客觀、簡單和快捷。水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速檢測試劑盒還未見有此類專利報導。本實用 新型專利利用ELISA技術建立了檢測水中微囊藻毒素MC-RR的快速檢測試劑盒及其檢測方 法。
實用新型內容本實用新型需要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、使用方便、可以 快速地檢測水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速檢測試劑盒，以及這種試劑盒的檢測方法。[0009]為了解決上述技術問題，本實用新型的技術方案是用於檢測水中微囊藻毒素 MC-RR的ELISA試劑盒的組成包括盒體，在盒體內設有微囊藻毒素MC-RR酶標物、微囊藻毒 素MC-RR標準品、包被微囊藻毒素MC-RR抗體的酶標板、酶標物稀釋試劑、洗滌試劑、顯色試 劑A、顯色試劑B、終止試劑、標本稀釋試劑。本實用新型還提供一種水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA檢測方法。本實用新型試劑盒的檢測原理為一種微囊藻毒素MC-RR快速檢測試劑盒是直接競爭酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。 已知微囊藻毒素MC-RR濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。微囊 藻毒素MC-RR標準品和樣品中的抗原競爭性地與酶標板上的微囊藻毒素MC-RR抗體結合。 再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然後加入顯色試劑A、B，和酶結合物同時作用， 產生顏色，顏色的深淺和樣品中微囊藻毒素MC-RR的濃度呈比例關係。本實用新型中檢測結果分析過程為用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度 平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(Btj)再乘以100%，即百分吸光度值。 計算公式為百分吸光度值(％)= (B/B0) X 100%以微囊藻毒素MC-RR標準品濃度(μ g/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標 準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品的百分吸光度值，相對應每一個樣品的濃度則可從標準 曲線上讀出樣本中微囊藻毒素MC-RR的含量。與現有技術相比，本實用新型具有如下的積極效果(1)本實用新型首次公開了一種檢測水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA試劑盒及檢 測方法，可定性或定量分析樣品中的微囊藻毒素MC-RR，適合工廠生產；(2)簡單快捷。本實用新型的試劑盒所有試劑均為已配製好的工作液，可以直接 操作無需處理，減少了操作步驟，可以快速，靈敏檢測水環境或藻類製品中的微囊藻毒素 MC-RR，避免了複雜的操作，對設備要求低，可以適應多種檢測環境，以及多種檢測需要；並 且本實用新型的試劑盒樣本用量小，試劑保存時間長，對操作者無毒性，對環境無汙染等；(3)靈敏度高。最小的檢測濃度小於等於0. 10ng/ml ；(4)特異性強。與其它微囊藻毒素結構類似物交叉反應率小於20% ；(5)重複性好。板內、板間變異數均小於10% ；(6)準確性高。回收率高。一般大於70%。
圖1 微囊藻毒素MC-RR的化學結構式；圖2 檢測微囊藻毒素MC-RR的試劑盒示意圖；1、微囊藻毒素MC-RR標準品，2、顯色試劑A、B，3、微囊藻毒素MC-RR酶標物酶標物4、酶標物稀釋試劑，5、標本稀釋試劑，6、洗滌試劑，7、終止試劑，8、包被微囊藻毒 素MC-RR抗體的酶標板圖3 微囊藻毒素MC-RR快速檢測試劑盒的標準曲線圖；圖4:人工抗原的合成圖。4具體實施例具體實施例1人工抗原的合成及鑑定微囊藻毒素MC-RR是一種小分子多肽，分子量為1038. 2，是一種典型的半抗原。將 它與載體蛋白結合而形成免疫抗原。為滿足研究需要，我們將MC-RR分別與兩種載體蛋白 結合，製備了免疫抗原和包被抗原。如圖4所示。1免疫抗原的製備微囊藻毒素MC-RR和匙孔血藍蛋白KLH採用「活潑酯法」偶聯，按合成反應式(1) 用 0. ImL DMF 溶解 0. 5mgMC_RR，加入溶解於 DMF 的 EDC · HCl 0. 75mg 和 NHS 0. 75mg,振蕩 5min,室溫反應30分鐘，4°C冰箱過夜，得MC-RR活潑酯衍生物(I ) Jmg KLH溶於3mL0. IM pH9. 6碳酸鹽緩衝液中，將上述MC-RR活潑酯衍生物(I )緩慢滴加入KLH溶液中，混勻，避 光室溫反應2小時。用0. OlM PBS透析三天後分裝，-20°C保存。抗原的鑑定採用紫外圖譜分析法進行鑑定，通過波長200 400nm範圍內的紫外 光譜掃描是鑑定偶聯物合成是否成功的常用方法。在波長238nm，測得偶聯比為17。注意KLH溶解時，輕輕搖勻，禁止劇烈振蕩。2包被抗原的製備微囊藻毒素MC-RR和牛血清白蛋白採用「碳二亞胺法」偶聯，按合成反應式(2)， 0.5 mg微囊藻毒素MC-RR溶解於0.25mL乙醇中，再加入0. 75mL去離子水，然後加入132 mgEDC · HC1，逐滴加入溶於lmL25%乙醇的2mgBSA，隨後再加入132 mgEDC · HC1，混勻，4°C 反應過夜。用0. OlM PBS透析三天後分裝，-20°C保存。具體實施例2微囊藻毒素MC-RR抗體的製備以微囊藻毒素MC-RR作為免疫原，第一次免疫1ml弗氏完全佐劑(FCA)與IOOug 抗原/ Iml PBS (一隻兔子用量)充分研磨混勻，達到「油包水」的狀態，分四點注射雙腋 下、腹股溝；第二次免疫間隔4周，換用弗氏不完全佐劑，其餘同第一次免疫；第三次免疫間隔4周，換用弗氏不完全佐劑，其餘同第一次免疫；測定血清效價，間接ELISA，IOug / ml抗原包被，效價1:64000以上可以放血，也 可以再加強免疫一次生理鹽水稀釋抗原，耳緣靜脈注射，一周內放血。具體實施例3微囊藻毒素MC-RR酶標物的製備酶標記抗體中的酶為辣根過氧化物酶(HRP)，HRP-微囊藻毒素MC-RR酶標記物採 用戊二醛交聯法製備，具體如下1.取 IOmg HRP 溶於 0. 2 mLl. 25% 戊二醛(用 0. 01mol/L、pH6. 8 磷酸鹽緩衝溶液 將25%戊二醛稀釋為1. 25%)，室溫(20°C左右)反應結合18h ；2.用0. 15mol/LNaCl平衡過的kphadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛， 或用 0. 01mol/L, ρΗ7· 2 PBS，4°C透析過夜；3.將5mg微囊藻毒素MC-RR抗體溶於ImLO. 15mol/L NaCl,再與醛化HRP溶液 (10mg/mL)混合；4.加入0. ImL lmol/L pH9. 6碳酸鹽緩衝液(調節pH至9. 0 9. 6)，4°C，電磁攪 拌下結合Mh ；5.加入0. ImLO. 2mol/L賴氨酸(0. 29g溶於IOmL蒸餾水)，4°C放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應；6.裝入透析袋，以 0. 01mol/L、pH7. 2 PBS，4°C透析過夜，或通過 kphadex G-200 凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液，加入等量60%甘油，測工作效價後，小量分裝， 4°C或_20°C保存。具體實施例4檢測微囊藻毒素MC-RR直接競爭ELISA試劑盒的組建ELISA檢測試劑盒包括以下組分1.微囊藻毒素MC-RR標準品濃度分別為 0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 25 μ g/L、0. 50 μ g/ LUyg/L 和 2μβ/1，共六瓶；2.包被微囊藻毒素MC-RR抗體的96孔聚苯乙烯酶標板，其製備方法如下按照常規方法用離子強度為0. 05mol/廣0. 10mol/L, pH9. 0 9. 6碳酸鹽緩衝液稀 釋包被抗體，將適量的包被抗體溶液加在聚苯乙烯酶標板上，4°C過夜。次日，加磷酸鹽緩衝 液洗板後，拍幹，用包被液量1509^200%體積比的BSA溶液(3g/L)封閉。然後，在矽膠乾燥 器內放置過夜，加乾燥劑密封包裝；3.微囊藻毒素MC-RR酶標物HRP_微囊藻毒素MC-RR酶標物濃度為1_10 mg/L ；4.底物顯色液:A液為0. lmol/L pH值為5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩衝液配製成 0. 3%過氧化氫儲備液，每ImL緩衝液加入15 μ L儲備液，製成使用液；B液為四甲基聯苯胺， 先用丙酮配成0. 2mg/mL溶液，用0. lmol/L pH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩衝液配製成 0. 2mg/L 溶液；5.洗滌液含0. 05%吐溫-20的PBST緩衝液，pH值為7. 4 ；6.酶標物稀釋液含0. 01%吐溫-20的PBST緩衝液，pH值為7. 4 ；7.樣品稀釋液含0. 1%吐溫-20的PBST緩衝液，pH值為7. 4 ；8.終止液2. Omol/L 的 H2SO4 溶液；9.蓋板膜為8cmX 12cm遮光防水不膠膜，可在潮溼環境下多次使用；10. 一次性滴管，包括廣3mL —次性塑料刻度滴管；所有試劑在盒內按使用順序擺放，試劑盒的保存溫度為4°C保存。具體實施例5樣品中微囊藻毒素MC-RR的檢測1.樣品前處理取待測水樣，用樣品稀釋液1:10稀釋，製備樣品溶液。2.試劑盒檢測(1)將向包被微囊藻毒素MC-RR抗體的酶標板中加入樣品或微囊藻毒素MC-RR標 準品，並加入微囊藻毒素MC-RR酶標物，同時設置空白和陰性對照孔；(2)輕輕振蕩30秒，37°C 30分鐘；(3)傾去孔內的液體，用洗滌液注滿各孔，然後倒掉洗滌液，如此反覆2-5次，最後 一次在吸水紙上拍幹；(4)加入顯色溶液A、B到酶標板孔中，37°C反應10-15min，顏色顯藍色，再加入終止液，立即變成黃色；(5)用酶標儀讀出0D450nm值，以不加微囊藻毒素MC-RR酶標物的小孔作為空白調零。3.結果分析繪製標準曲線，相對應每一個樣品中微囊藻毒素MC-RR的含量可從標準曲線上讀6出，也可以用回歸方程計算出樣品中微囊藻毒素MC-RR的含量。測得的吸光度與樣品中的 微囊藻毒素MC-RR含量成反比，可通過標準曲線計算微囊藻毒素MC-RR的含量。 雖然結合以上實施例來描述本實用新型，但應當理解本實用新型並不限於所公開 的實施例和附圖，而是覆蓋了落在本實用新型精神和範圍內的所有修改和變形。
權利要求1. 一種微囊藻毒素MC-RR快速檢測試劑盒，組成包括微囊藻毒素MC-RR酶標物、 微囊藻毒素MC-RR標準品、包被微囊藻毒素MC-RR抗體的酶標板、酶標物稀釋試劑、洗滌試 劑、底物試劑、顯色試劑、終止試劑、標本稀釋試劑。
專利摘要本實用新型提供一種微囊藻毒素MC-RR的快速檢測試劑盒。試劑盒的組成包括微囊藻毒素MC-RR酶標物、微囊藻毒素MC-RR標準品、包被微囊藻毒素MC-RR抗體的酶標板、酶標物稀釋試劑、洗滌試劑、顯色試劑A、顯色試劑B、終止試劑、標本稀釋試劑。本實用新型還公開了一種應用上述試劑盒檢測水中微囊藻毒素MC-RR的方法，它包括首先進行樣品前處理，然後用試劑盒進行檢測，最後分析檢測結果。應用ELISA試劑盒檢測水中的微囊藻毒素MC-RR，具有檢測特異性強、靈敏度高、分析能力大、檢測速度快、費用低廉等優點，能適應大規模樣品的快速篩查和預警監測。
文檔編號G01N33/543GK201828561SQ20102054817
公開日2011年5月11日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者單金蓮, 孫秀蘭, 張根義, 朱程琳, 杜前明, 趙春城, 鄭立功, 陳波 申請人:無錫百奧森科技有限公司