抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA及應用的製作方法
2023-07-04 11:39:21
專利名稱：：抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA及應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於分子生物學與生物醫藥
技術領域：
，具體為抑制VEGF蛋白表達和增殖的siRNA序列及應用。
背景技術：
：RNAi是雙鏈RNA介導的轉錄後基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，在此情況下啟動子是活躍的，靶基因能被轉錄，但不能正常積累mRNA。各種體內外實驗證實21-23個nt的短雙鏈RNA，g卩siRNA(shortinterferenceRNA，siRNA)，可在哺乳動物細胞組織內引起基因封閉作用，其結構穩定，無須象反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高其半衰期，並能在低於反義核苷酸幾個數量級的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全"敲除"，從而產生缺失突變表型。siRNA的幹預效應關鍵取決於其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導致RNAi效應的喪失，這種高度序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。已證明，siRNA技術可單獨或與其它現有的治療手段一同用於突變所致的疾病，如病毒感染、脊髓延髓肌肉蔞縮症(SBMA)，還可用於治療腫瘤。血管內皮生長因子(VEGF)通過促進內皮細胞的增殖、生存和遷移而刺激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生長以及生殖活動中是一種生理性血管生成的關鍵調節因子，在腫瘤的血管生成中發揮著關鍵作用。在各種腫瘤和白血病細胞中，都已經發現VEGF表達上調，而且它與腫瘤和白血病的進展和預後差密切相關。肝癌作為實體瘤，其發生、發展與腫瘤血管生成有著密切的聯繫。VEGF在肝癌中高表達，與肝癌的分期、分級以及預後密切相關。將VEGF作為RNA幹擾的靶標，禾擁VEGFsiRNA阻斷VEGF及其受體的信號轉導途徑，從而阻斷VEGF促血管形成，達到抑制肝癌細胞增殖的目的。因此，通過幹擾VEGFmRNA，阻斷血管形成，抑制腫瘤的生長、復發和轉移已經成為腫瘤治療的一種新策略。
發明內容本發明的目的在於提供能在細胞和蛋白水平上抑制肝癌和白血病細胞株VEGF表達的siRNA以及提供該siRNA在製藥中的應用。為達上述目的，發明人採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA序列，通過實驗篩選以下9條高效VEGFsiRNA序列(見表l):表l9條高效VEGFsiRNA序列tableseeoriginaldocumentpage4上述任一條VEGFsiRNA可用於製備抗腫瘤、抗肝癌或抗白血病的藥物。RNA幹擾技術是將一段雙鏈的siRNA導入細胞，使具有同源序列的基因表達受到抑制，是腫瘤基因治療的新領域。本發明的siRNA序列的長度均為19bp，這些siRNAs既足夠長誘導基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主幹擾素反應。本發明將上述針對VEGFmRNA編碼區不同位置的9條VEGFsiRNA序列分另導入肝癌7721細胞和白血病細胞HL60,結果顯示肝癌細胞和白血病細胞的增殖受到抑制，同時VEGF蛋白的表達量降低。雖然針對同一耙基因，但位置不同，效果不同。本發明從細胞的增殖和靶基因蛋白的表達得到的結果是一致的。9條VEGFsiRNA序列均能抑制肝癌細胞和白血病細胞的生長和增殖，以VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6和VEGFsiRNA9的效果好，且均優於反義寡核苷酸對照組。ELISA法檢觀!J，與空白對照組相比，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組細胞VEGF蛋白的表達水平明顯地降低，VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7抑制靶基因表達的效果最好。可見，RNA幹擾在腫瘤和白血病的基因治療方面的效果優於與反義技術。VEGFsiRNA因其序列的特異性，可以特異地降解VEGFmRNA，從而降低VEGF蛋白的表達水平；VEGFsiRNA具有雙鏈結構，比反義寡核苷酸更易抵禦細胞內核酶的降解；VEGFsiRNA不需要化學修飾，可以避免反義寡核苷酸全硫代修飾引起的細胞毒性。因此，VEGFsiRNA可成為腫瘤和白血病基因治療的重要工具。圖l是各實驗組分別作用於SMMC7721細胞後MTT法測得各組細胞的存活率比較圖。*表示有統計學意義。圖2是各實驗組分別作用於SMMC7721細胞後CCK8法測得各組細胞的存活率比較圖。*表示有統計學意義。圖3是各實驗組分別作用於SMMC7721細胞後ELISA法測得各組細胞VEGF蛋白表達水平比較圖。*表示有統計學意義。圖4是各實驗組分別作用於HL60細胞後MTT法測得各組細胞的存活率比較圖。具體實施方式實施例一VEGFsiRNA的設計與合成。從Genbank獲得VEGFmRNA全序列，採用以下原則設計siRNA序列①在mRNA的起始密碼子AUG的下遊50100nt處開始設計；②以AA(N19)為模式；③G/C的百分比為30%~70%;④一行中不要有4個以上的A或T;⑤一行中不要有4個及以上的G;⑥一行中不要有7個連續的GC鏈延伸；⑦完成序列比對(BLAST),以保證特異性；⑧結合RNAstructure3.7軟體，計算總自由能overallAG37。表2顯示，設計VEGFsiRNA序列9條，同時設計反義寡核苷酸對照(中國專利申請號03139788.3)，陽性對照(針對GAPDH基因)。siRNA模板和反義藥物(全硫代修飾)由上海生工生物工程有限公司合成，使用Ambion公司的siRNA構建試劑盒合成VEGFsiRNA。表2設計的VEGFsiRNA及反義對照、陽性對照名稱靶標位置正義鏈序列反義鏈序列總自能TargetSense(5'-3')Antisense(3'-5')OverallVEGFsiRNAl106-126UCAUCACGAAGUGGUGAAGUUUUAGUAGUGCUUCACCACUUC-12.7VEGFsiRNA2386-406UGCAGACCAAAGAAAGAUAUUUUACGUCUGGUUUCUUUCUAU-15.9VEGFsiRNA3539-559GAUCCGCAGACGUGUAAAUUUUUCUAGGCGUCUGCACAUUUA-9.9VEGFsiRNA4337-357GGCCAGCACAUAGGAGAGAUUUUCCGGUCGUGUAUCCUCUCU-5.3VEGFsiRNA5588-608GGCGAGGCAGCUUGAGUUAUUUUCCGCUCCGUCGAACUCAAU-0.8VEGFsiRNA6615-635CGUACUUGCAGAUGUGACAUUUUGCAUGAACGUCUACACUGU-17.2VEGFsiRNA7401-421GAUAGAGCAAGACAAGAAAUUUUCUAUCUCGUUCUGUUCUUU-14.3VEGFsiRNA8610-630CGAACGUACUUGCAGAUGUUUUUGCUUGCAUGAACGUCUACA-17.8VEGFsiRNA9423-443UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUUUUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU-12.8VEGF反義81-100GGGTGCAGCCTGGGACCACT陽性對照GAPDH模板由ambion公司試劑盒提供實施例二MTT法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果。人的肝癌SMMC7721細胞培養於RPMI1640培養液中(含10%小牛血清、青黴素和鏈黴素的終濃度為100U/毫升)，置於37'C、含5%<302溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對數生長期的SMMC7721細胞，配製2.0xl0VmL起始濃度細胞，每孔加100mL到96孔培莽板內(Coming,美國)，設空白對照組、脂質體對照組(Invitrogen公司)、陽性對照組(針對GAPDH基因)、反義組(25nmol/L)及siRNAl-9組(25nmol/L)。每組5孔，接種24h後棄去上清，轉染siRNAl-9和對照組，置37。C，飽和溼度，5%C02培養箱中無血清繼續培養4h，再各補加無雙抗含10%胎牛血清的1640lOOpL，72h後加入MTT20|117孔，孵箱內孵育4h後棄上清，加入DMSO150|117孔，在570nm的波長的酶標儀下檢測各組的吸光度。MTT實驗中通過方差分析發現各個組別之間的差異有統計學意義(F-20.21,PO.Ol)。VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組與空白對照組之間均有顯著差異，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9對細胞增殖的抑制效果均好於反義藥物組。結果見圖1和表3。表3MTT法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果tableseeoriginaldocumentpage7與空白對照組相比，*表示？<0.05，"表示PO.Ol與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol實施例三CCk8法檢測各實驗組siRNA抑制肝癌SMMC7721細胞增殖的效果。人的肝癌SMMC7721細胞培養於RPMI1640培養液中(含10%小牛血清、青黴素和鏈黴素的終濃度為100U/毫升)，置於37t:、含5%032溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對數生長期的7721細胞，配製1.0xlS/mL起始濃度細胞，接種96孔板，每孑LlOOul,置37"，飽和溼度，5%C02培養箱內培養。於72h每孔加入10ul的CCK8試劑，然後把培養板放在C02培養箱內繼續培養2小時，在450mn波長處測定吸光度，參考波長為655nm。細胞存活率=實驗組吸光度/對照組吸光度xlOOY。。使用CCK8試劑盒測定各個藥物組別。經過方差分析，各個實驗組之間有統計學差異(F=17.46，PO.Ol)，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組與空白對照組之間均有顯著差異(PO.01);兩兩比較分析發現VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsi認A9的效果均好於反義藥物組，而VEGFsiRNAl、VEGFsiRNA3、VEGFsiRNA5與反義藥物組沒有差異。結果見圖2和表4。表4CCK8法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果組別xs(OD值)細胞存活率％VEGFsiRNAl0.9390.129"46.30VEGFsiRNA20.7260.052**AA35.76VEGFsiRNA31.0060細**49.59VEGFsiRNA40.76337.60VEGFsiRNA51.0490.245**51.67VEGFsiRNA60.7890.094**M38.91VEGFsiRNA70.7320.163**M36.08VEGFsiRNA80.7810.184**AA38.50VEGFsiRNA90.7360.174**AA36.26陽性對照組1.2960.30263.84脂質體對照組1.4240.32170.19反義藥物組1.1750.19857.89空白對照組2,029o.m100.00與空白對照組相比，4表示P0.05，"表示P〈0.01與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol實施例四VEGFsiRNA抑制肝癌SMMC7721細胞VEGF蛋白表達的測定。人的肝癌SMMC7721細胞培養於RPMI1640培養液中(含10%小牛血清、青黴素和鏈黴素的終濃度為100U/毫升)，置於37"C、含5%032溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。將對數生長期的SMMC7721細胞接種96孔板，每孔100ul，置37"，飽和溼度，5%C02培養箱內培養。SiRNAl-9組和反義寡核苷酸藥物組按25nm分別轉染細胞，72h後離心收取上清夜，VEGF蛋白測定按人VEGFELISA試劑盒說明書操作(晶美生物工程有限公司)，加入終止液混勻後即刻用酶標儀(BIO-RID公司)測定OD45。值，標準品和樣品孔的OD值減去空白孔的OD值。以標準品的OD值為縱坐標，標準品的濃度(pg/ml)為橫坐標，繪製標準曲線並求出標準曲線方程。通過樣品的OD值在標準曲線方程內求出樣品VEGF濃度。結果見圖3和表5。表5ELISA法分析各實驗組的細胞VEGF蛋白的表達水平組別細胞培養液中VEGF濃度pg/ml(xs)VEGF蛋白抑制率。/0VEGFsiRNAl2510.5330.87"34.74VEGFsiRNA21906.84160.15**AA50.43VEGFsiRNA32568.95267.10**33.22VEGFsiRNA42086.3245.83AA45.77VEGFsiRNA52171.58170.52**A43.55VEGFsiRNA62620.53307.01**31.88VEGFs腿A71821.58158.8252.65VEGFsiRNA82085.2660.57**AA45.79VEGFsiRNA92585.7952.71**32.78陽性對照組2963.68136.7022.96脂質體對照組2918.95167.9524.12反義藥物組2735.26102.1528.90空白對照組3846.84906.150與空白對照組相比，*表示？<0.05，^表示P0.01與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol實施例五CCK8法檢測各實驗組siRNA抑制白血病HL60細胞增殖的效果。分別用25nM，50nM，100nM的VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7和反義藥物組作用HL60細胞，結果轉染24小時，採用嵌套設計資料的方差分析發現，同一藥物的不同濃度之間無統計學差異，而不同組別之間差異顯著(F=4.231，P=0.016)，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7與空白對照組有差異，而反義藥物組與空白對照組無統計學差異。結果見圖4和表6。表6轉染藥物24小時後的細胞生長狀況tableseeoriginaldocumentpage10實施例六VEGFsiRNA在製備抗肝癌和白血病藥物中的應用。取實施例一合成的VEGFsiRNAl9中任一條序列，配製成濃度為25nmo1/1的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內進行治療。實施例七VEGFsiRNA在製備抗肝癌和白血病藥物中的應用。取實施例一合成的VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7，混合配製成濃度為25nmol/l的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內進行治療。SEQUENCELISTING暨南大學抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA及應用118Patentlnversion3.2121RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNAl序列正義鏈1ucaucacgaaguggugaaguu21221RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNAl序列反義鏈2uuaguagugcuucaccacuuc21321RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA2序列正義鏈3ugcagaccaaagaaagauauu21421RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA2序列反義鏈4uuacgucugguuucuuucuau21521RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA3序列正義鏈5gauccgcagacguguaaauuu21621RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA3序列反義鏈6uucuaggcgucugcacauuua21721RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA4序列正義鏈7ggccagcacauaggagagauu21821RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstiucture3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA4序列反義鏈8uuccggucguguauccucucu21921RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA5序列正義鏈9ggcgaggcagcuugaguuauu211021RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA5序列反義鏈10uuccgcuccgucgaacucaau211121RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA6序列正義鏈ncguacuugcagaugugacauu211221RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA6序列反義鏈12uugcaugaacgucuacacugu211321RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA7序列正義鏈13gauagagcaagacaagaaauu211421RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructoe3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA7序列反義鏈14uucuaucucguucuguucuuu211521RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA8序列正義鏈15cgaacguacuugcagauguuu211621RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則井結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA8序列反義鏈16uugeuugcaugaacgucuaca211721RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA9序列正義鏈17ucaguucgaggaaagggaauu211821RNAArtificialsequence採用siRNA設計法則並結合RNAstructure3.7軟體輔助設計VEGFsiRNA9序列反義鏈18uuagucaagcuccuuucccuu211權利要求1、一種抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA，其特徵在於所述siRNA序列如下VEGFsiRNA9正義鏈UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUU；反義鏈UUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU。2、權利要求l所述的siRNA序列用於製備抗腫瘤的藥物。3、權利要求l所述的siRNA序列用於製備抗肝癌的藥物。4、權利要求l所述的siRNA序列用於製備抗白血病的藥物。全文摘要本發明屬於分子生物學與生物醫藥
技術領域：
，具體為9條抑制VEGF蛋白表達的增殖的siRNA序列。經過MTT和CCK8法檢測，9條VEGFsiRNA改變SMMC7721細胞的生物學特性，抑制腫瘤和白血病細胞的生長和增殖，ELISA檢測9條VEGFsiRNA序列均可下調VEGF蛋白的表達。形態學觀察，VEGFsiRNA能引起腫瘤和白血病細胞發生形態變化。因此，VEGFsiRNA可用於製備抗腫瘤和白血病的藥物。文檔編號A61P35/02GK101113446SQ20071013725公開日2008年1月30日申請日期2005年6月3日優先權日2005年6月3日發明者洹張,荊春霞申請人:暨南大學