D‑色氨酸在抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成中的應用的製作方法

2023-05-26 18:38:47

本發明涉及d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成中的應用，屬於生物醫學技術領域。

背景技術：

d-色氨酸(d-tryptophan，d-trp)是一種淺褐色的晶體，分子式是c11h12n2o2，分子量204.23g/mol，熔點是282-285℃。d-色氨酸的分子結構圖如圖1所示。有研究證明d-色氨酸一定程度能分散多種細菌，包括枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等細菌的生物被膜。

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是臨床常見的多重耐藥菌，生物被膜(biofilm,bf)的形成是主要的耐藥機制之一，延緩及抑制生物被膜的形成的我們亟待解決的問題。細菌生物被膜是指細菌附著在物體的表面，隨後分泌胞外多糖，蛋白質，脂質，胞外dna等組成胞外聚合物，將自身微菌落包裹其中形成的細菌聚集體膜狀物。

銅綠假單胞菌生物被膜的形成是一個由多系統參與的複雜的過程，其中群體感應系統佔主導地位。las系統和rhl系統是主要的群體感應系統，主要成分分別由rhli、rhlr和lasi、lasr編碼產生。大致形成過程如下:起初，細菌的粘附是可逆的(0-2h)，隨著越來越多的細菌粘附在物體表面，可逆性粘附逐漸轉變成不可逆粘附(2-8h)，細菌不斷分泌蛋白質，脂質、胞外多糖、edna，逐漸從微菌落的聚集演變形成一個成熟的三維蘑菇狀bf結構(5days)。

自然界和醫療設備中普遍存在著細菌生物被膜，銅綠假單胞菌有極強的生物被膜形成能力，生物被膜的產生可引起致病菌耐藥性的增加，與浮遊菌相比，產生物被膜的細菌耐藥力可提高10-1000倍。生物被膜產生耐藥的機制主要包括滲透限制、營養限制、特定耐藥基因的表達、外排泵激活、耐藥株細胞的產生等。同時生物被膜可使細菌產生免疫逃避，常規的治療難以根除細菌生物被膜，繼而導致慢性感染及耐藥菌的產生。其中銅綠假單胞菌生物被膜相關的感染有導管相關性感染(包括導尿管、氣管插管、深靜脈置管等)、囊性纖維化肺部感染、隱形眼鏡相關角膜炎、創面慢性感染等，為臨床治療帶來了極大困擾。

技術實現要素：

本發明的目的之一，是提供d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜形成中的應用。d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成，且d-色氨酸的起效濃度低，毒副作用小，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑，爭取更多的治療時間。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成中的應用。

本發明的申請人經過d-色氨酸作用銅綠假單胞菌24小時內的抗菌效果試驗、d-色氨酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成早期細菌的不可逆粘附的影響試驗發現，d-色氨酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成早期的細菌粘附抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>35％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>65％。由此可見，d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑，爭取更多的治療時間銅綠假單胞菌的感染。

本發明的目的之二，是提供一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物。d-色氨酸可用於輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應用於創傷、燒傷、供皮區以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且安全性高，應用人群廣。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

採用上述進一步的有益效果是：將d-色氨酸製成更多劑型，並應用在醫用材料上，能更廣泛的發揮d-色氨酸抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的抑制作用，尤其是配伍臨床抗生素使用，對銅綠假單胞菌感染有更優選的治療。

本發明的有益效果是：

1.d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

2.d-色氨酸可以有效減少銅綠假單胞菌感染後細菌的早期粘附，延緩生物被膜的形成，為臨床爭取更多的最佳用藥時間。

3.d-色氨酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成早期的細菌粘附抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>35％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>65％。

4.d-色氨酸可用於輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應用於創傷、燒傷、供皮區以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應用人群廣。

附圖說明

圖1是本發明d-色氨酸的分子結構圖。

圖2是本發明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1生物被膜形成早期的抑制作用。

圖3是本發明d-色氨酸作用銅綠假單胞菌pao124小時內的抗菌效果。

圖4是本發明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1中rhli、rhlr、lasi、lasr基因表達的影響。

具體實施方式

以下結合具體附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。

實施例1：d-色氨酸作用銅綠假單胞菌24小時內的抗菌效果

本發明用研究常用的銅綠假單胞菌pao1為實驗菌株，首先測定0-10mmd-色氨酸作用pao124小時內的抗菌效果。先將pao1菌種保存管從-80℃取出，接種至lb固體培養基(氯化鈉10g、蛋白腖10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g，加超純水定容至1000ml，經121℃高壓滅菌30min)，37℃培養24h，將菌株復甦；挑取1mm2大小的單克隆菌落至含有4mllb液體培養基，放在恆溫培養箱，37℃，200rpm培養6-8h至細菌對數生長期；各取含0、0.1、1、10mmd-色氨酸的lb液體培養基100ml於乾淨的250ml錐形瓶，加入對數期生長期的pao1菌液，調節至0.05麥氏濁度；將錐形瓶放在37℃恆溫培養箱，150rpm培養24h，每2h用移液器吸取1ml菌液於1.5mlep管中，1000rpm離心5min後棄液用1ml無菌生理鹽水重懸，取200μl洗滌去除培養基後的菌液於96孔板中；酶標儀檢測波長600nm處的吸光值，記錄od600，結果見圖3，發現24小時內，10mm以下的d-色氨酸對pao1無明顯抗菌效果。

實施例2：d-色氨酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成早期細菌的不可逆粘附的影響

2-1取-80℃保存的銅綠假單胞菌pao1，接種於lb固體培養基，37℃倒置過夜培養；次日挑取單菌落至含4mllb液體培養基的試管中，37℃，200rpm振蕩培養至對數期(5-7h)；用新鮮配製的20％lb液體培養基將細菌調至0.5麥氏濁度；用新鮮配製的20％lb液體培養基溶d-色氨酸分別至0.1、1、5、10mm，過濾備用；在96孔板中建立體外生物被膜，在對照孔及中加入180μl20％lb，實驗孔中加入180μl含0.1、1、5、10mmd-色氨酸的20％lb液體培養，每組3個復孔，將96孔板靜置放於恆溫培養箱，37℃培養6h；棄去各孔培養基後，用超純水洗滌96孔板洗去游離菌，洗3遍，自然風乾；每孔加150μl0.1％結晶紫染液，15min後吸去染液，用超純水洗滌3遍洗去未結合的結晶紫，自然風乾；每孔加200μl95％乙醇脫色30min；脫色完全後，用酶標儀檢測od590。實驗結果如圖2所示。生物被膜培養6小時為生物被膜形成早期的細菌不可以粘附階段，d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1該階段的細菌粘附有抑制作用，而且隨著d-色氨酸濃度的的增加，抑制作用也隨之增高，d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>35％，10mm時的抑制率>65％。

2-2將銅綠假單胞菌pao1按2-1中步驟培養6小時後，收集各組菌液後離心。所得沉澱按照rneasyminikit提取試劑盒的標準操作流程提取各組的rna，測定各組rna濃度後，按體系配比(20μl體系：primescriptrtmastermix4μl、cdna1μg、超純水添至20μl)進行cdna逆轉錄。經普通pcr驗證cdna能擴增生物被膜形成相關基因lasi、lasr、rhli、rhlr(具體引物序列見表1)，下一步進行螢光定量pcr。配製20μl體系包括：premixextorqⅱ10μl，上下遊引物各0.8μl，cdna稀釋10倍後取2μl，超純水6.4μl。反應條件為：95℃5s，(95℃5s，61℃30s，72℃20s)×40個循環。擴增產物用管家基因rpsl的量歸一化後再進行比較，實驗重複三次。結果見圖3。lasi、lasr、rhli、rhlr這四個基因是銅綠假單胞菌形成生物被膜的主要調控基因，如圖4所示，不同濃度的d-色氨酸對這4個基因的表達均有一定的抑制作用，與2-1中結果相一致，進一步驗證了d-色氨酸對銅綠及單胞菌生物被膜形成早期的抑制作用。

表1pcr相關引物匯總表

由此可見，d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成。

實施例3

一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。