一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法與流程
2023-05-26 19:49:32 5
本發明屬於生物檢測技術領域，涉及微生物快速檢測方法，特別是涉及一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法。
背景技術：
環介導的等溫擴增技術(LAMP)是日本科學家Notomi發明的一種新型核酸擴增技術。與傳統核酸擴增技術相比，LAMP不僅擴增時間短，而且憑藉極高的擴增效率及較低的儀器要求，LAMP技術具有良好的現場、野外檢測及資源有限的基層實驗室檢測應用前景。目前LAMP技術已被應用於致病性微生物、致病性寄生蟲、轉基因成分、腫瘤診斷，以及食品過敏原等領域。
目前用於LAMP檢測的主要有凝膠電泳法、濁度法、SYBR Green I螢光法、鈣黃綠素法、羥基萘酚藍法等幾種方法。然而，這些方法在檢測實際樣本時仍然具有一些諸如特異性及靈敏度等局限性。因此，發展新的高靈敏LAMP可視化策略對快速檢測技術的發展具有現實意義。
技術實現要素：
本發明主要解決的技術問題是提供一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法，能夠實現LAMP可視化檢測及提高樣本檢測靈敏度。
為解決上述技術問題，本發明採用的一個技術方案是：提供一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法，包括：
用氫氧化鈉配製鎂試劑I溶液；
基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測反應體系包括：Bst DNA聚合酶緩衝液、Bst DNA聚合酶、甜菜鹼、鎂離子、dNTP Mix、LAMP引物混合物，以及DNA模板；
對所述反應體系在一定擴增條件下進行擴增後，加入鎂試劑I溶液，然後觀察試管顏色變化，並判定檢測結果。
其中，所述鎂試劑I溶液是由0.4-0.6mol/L的NaOH配製而成。
其中，所述反應體系中鎂試劑I溶液的濃度為0.1-0.4mmol/L。
其中，所述反應體系中鎂離子的濃度為3.0-10.0mmol/L。
其中，所述反應體系中Bst DNA聚合酶用量為每25μL體系中含6-8U。
其中，所述反應體系中甜菜鹼濃度為8-12mmol/L。
其中，所述反應體系中dNTP Mix濃度為1.2-1.6mmol/L。
其中，所述反應體系中每25μL體系中含DNA模板1-2μL。
其中，所述反應體系中LAMP引物混合物包含外引物(F3和B3)、內引物(FIP和BIP)、環引物(LF和LB)，各引物濃度和比例如下：外引物(F3和B3)的濃度為0.1-0.3μM/L，內引物(FIP和BIP)的濃度為1.2-1.8μM/L，環引物(LF和LB)的濃度為0.2-0.6μM/L；外引物(F3和B3)、內引物(FIP和BIP)、環引物(LF和LB)的摩爾比為：1∶8∶2。
其中，所述擴增條件為在60-65℃下反應15-60分鐘，並在80℃反應2-4分鐘。
其中，根據反應後顏色進行檢測結果判定：黃色表示陰性，紫紅色表示陽性。
附圖說明
圖1是本發明實施方式一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法的流程圖；
圖2是本發明實施方式一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法效果；
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明實施方式的方法作進一步說明。
實施例1基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法
步驟S101：按照常規方法提取沙門氏菌基因組DNA作為LAMP可視化檢測的模板。
步驟S102：在LAMP可視化檢測反應體系分別加入緩衝液、BstDNA聚合酶、甜菜鹼、鎂離子、dNTP Mix、引物組以及DNA模板。
步驟S103：對步驟S102得到的反應體系進行擴增，反應結束後加入鎂試劑I溶液，然後根據試管顏色變化判定檢測結果。
基於鎂試劑I的可視化LAMP可視化檢測方法的擴增反應體系，其中25μL的反應體系為：LAMP引物混合物1μL，Bst DNA聚合酶8U，反應液8.5μL，樣本DNA 1μL，染料1.5μL，然後用無菌去離子水補足至25μL。配製好的反應體系在PCR管混勻後，於62℃反應60分鐘，並在80℃反應3分鐘。然後觀察顏色試管顏色變化，判定檢測結果如圖2所示，在該反應體系下，對照中鎂離子與鎂試劑I結合成黃色，而陽性樣本中，因鎂離子被消耗，鎂試劑I呈紫色。
實施例2NaOH濃度對LAMP可視化檢測的影響
首先，配置分別配製濃度為0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M及0.7M的NaOH溶液，然後用不同濃度的NaOH溶液配製鎂試劑I染料溶液；按照實施例1所述的方法進行檢測，優化不同NaOH濃度配製的鎂試劑I溶液對檢測的影響。結果顯示，NaOH濃度在0.4-0.6M之間時，對照為黃色，樣本為黃紫色或紫色，對照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區間配製的鎂試劑I溶液可以用於檢測，其中0.5M的NaOH濃度效果最好。
表1 NaOH濃度對LAMP可視化檢測的影響
註：根據對照和樣本的顏色差異來判定該方法是否可以用於檢測。
實施例3鎂試劑I濃度對LAMP可視化檢測的影響
首先，配置配製濃度為0.5M的NaOH溶液，然後用該濃度的NaOH溶液配製3.5mM濃度的鎂試劑I溶液；按照實施例1所述的方法進行檢測，加入不同體積3.5mM濃度的鎂試劑I溶液，優化體系中不同鎂試劑I濃度對檢測的影響。結果顯示，體系中鎂試劑I濃度為0.1-0.4mM，對照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區間均可以實現檢測，其中以0.2mM時，檢測效果最佳。
表2鎂試劑I濃度對LAMP可視化檢測的影響
註：根據對照和樣本的顏色差異來判定該方法是否可以用於檢測。
實施例4鎂離子濃度對LAMP可視化檢測的影響；
按照實施例1所述的方法進行檢測，在檢測體系中，加入不同體積鎂離子溶液，優化體系中不同鎂離子濃度對檢測的影響。結果顯示，體系中鎂試劑I濃度為5.0-7.0mM時，對照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區間均可以實現檢測，其中以6.0mM時，檢測效果最佳。
表3鎂離子濃度對LAMP可視化檢測的影響
註：根據對照和樣本的顏色差異來判定該方法是否可以用於檢測。
實施例5是一種基於鎂試劑I的LAMP可視化檢測方法的靈敏度；
首先用常規方法培養沙門氏菌，按照實施例1中的方法提取基因組DNA，並使用核酸定量方法對基因組DNA進行定量；定量的基因組DNA用無菌的TE進行濃度調整得到100ng/μL的模板，並進行梯度稀釋得到不同濃度的基因組DNA；按照實施例1描述的方法進行檢測，結果顯示本方法的最低檢出度為1pg基因組DNA。
表4一種基於鎂試劑I的可視化LAMP可視化檢測方法靈敏度試驗
註：「+」代表結果為陽性，「-」代表結果為陰性。