一種用巢式pcr鑑定肝素豬、牛、羊來源的方法

2023-05-26 10:19:41

專利名稱：一種用巢式pcr鑑定肝素豬、牛、羊來源的方法
技術領域：
本發明是一種定性檢測肝素來源成分的準確檢測方法，具體地說是利用分子生 物學技術對肝素粗成品中成分來源的高效定性檢測方法。
背景技術：
肝素是一種由動物結締組織的肥大細胞產生的粘多糖，是一種天然抗凝血物質， 它在抗凝血，促進脂蛋白酶釋放和補體溶細胞體系等方面具有活性，被廣泛用於治療血栓塞、 暴發性流腦、敗血症、腎炎、急性心肌梗塞、動脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質，降低 膽固醇等作用。
由於肝素至今尚無法化學合成，只能從動物屠宰後的下腳料中提取，主要從豬、牛、羊 的肺臟、腸黏膜等動物臟器等組織中提取得到。市場需求量極大，我國是世界上肝素鈉主要 出口國家之一，佔世界市場55%以上的份額，但由於"狂牛症"的泛濫，統計表明在負作用 方面豬源肝素明顯小於其它來源的肝素，所以歐美各國在肝素進口方面明確要求以豬副產品 為原料提取的產品，同時加大了對中國出口肝素產品的質量、來源等方面的質量要求和抽檢 力度。目前國內的相關標準較為混亂，出現了一些技術標準不一致，法規滯後，與國際慣例 不接軌，而且大部分廠家還沒有形成一套可信、方便的自檢體系以便做到心中有數，儘量減 少不必要的損失。本發明是基於上述情況的一種便於推廣的運用巢式PCR技術對肝素來源的 定性檢測方法。
自20世紀60年代，線粒體DNA (mtDNA)得到證實以來，目前很多種動物的mtDNA的 全序列已經全部測定。mtDNA為細胞核外遺傳物質，以母系單性遺傳、結構簡單、在世代遺 傳中不發生重組、進化速度快為特點。mtDNA在種間、種內群體間和群體內具有廣泛的多肽 性，線粒體DNA因其種屬特異性強，在分子進化中有許多獨特的優越性，是研究動物種間進
化、進行種屬鑑定、特異的遺傳標記，現已廣泛應用在分子分類學等領域。
Polymerase Chain Reaction (PCR)由1985年的cetus公司的Karry Mu出s首創。以DNA 為模板，在4種核苷酸存在條件下，借DNA聚合酶形成酶促反應，PCR最主要的組分是引物。 加熱使雙鏈DNA變成單鏈，denaturation變性。當溫度驟然降低，引物特異與單鏈結合， 同時4種核苷酸在DNA聚合酶促下，5-3聚合，使DNA鏈不斷延伸。
發明人根據mtDNA的基本特性，設計出特異的引物，利用分子分類學方法找到豬、牛、 羊三種動物mtDNA上的種屬特異性片段，從而可以定性檢測肝素樣品的來源
發明內容
本發明提供了一組可以專門用於PCR鑑定檢測肝素粗製樣品的來源組成(豬、 牛、羊)的引物，並建立了基於上述引物的穩定定性鑑別的PCR反應體系。根據Genbank公 布的豬、牛、羊線粒體DNA序列，經同源性比對後，利用Primer 5. 0與Oligo 6軟體輔助設 計引物。具體如下
1、用於鑑定的特異性引物 (1)豬成分擴增引物名稱及序列
第一輪擴增片段長度385 bp
Por—mt F 5， 一aaacatgaaacattggagtagtcc-3， Po「mt R 5' - aggattagtattataaataaggctcc-3'
第二輪擴增片段長度80 bp
P2-5: 5' -TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3' P2—3: 5' —GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG 3'
(2) 牛成分擴增引物名稱及序列
第一輪擴增片段長度295 bp
Bov-mt F 5， -ttttaagttagagattgagagcc-3 ， Bov-mt R 5， -aatagtaggcttgggaatagtac-3，
第二輪擴增片段長度128 bp
B2-5: 5' -ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3'
(3) 羊成分擴增引物名稱及序列 第一輪擴增片段長度319 bp
Y肌g—mt F 5， 一atttgcctctttcattacccc-3， Yang-mt R 5， -tcctgctcataagggatagcc-3'
第二輪擴增片段長度112 bp
S2-5: 5' TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA3' S2-3: 5'TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
2、構建的反應體系如下
第一輪PCR反應體系及反應條件-
總反應體系為25ul，其中含DNA模板(100 ng/ul) 1 ul， dNTPs(10 mM) 0.2 ul， 10 XPCR緩衝液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul， 無菌超純水補足至25 ul。擴增反應條件為95°C 3min, 95°C 40 s， 56°C 40 s, 72°C 40 s，
共30個循環，最後72'C延伸10 min。
第二輪PCR反應體系及反應條件 取第一輪反應產物稀釋100倍作為第二輪擴增的模板。
總反應體系為25 ul,其中含DNA模板1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul， 10XPCR緩衝 液2.5 ul,內部正反向引物(20 uM)各1 ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul，無菌超 純水補足至25 ul。擴增反應條件為95°C 3 min， 95°C 20 s， 56°C 20 s， 72°C 20 s，共 30個循環，最後72"延伸10 min。


圖l、為本發明豬牛羊引物的種特異性分析結果電泳圖A為豬引物，B為牛引 物，c為羊引物；1， 2, 3泳道分別為豬、牛和羊DNA模板，4為空白對照。豬、牛、羊引物 擴增片段長分別為377bp、 271bp和295bp。陰性對照無擴增說明PCR體系無汙染。豬牛羊引 物對豬牛羊成分的特異性擴增表明本發明設計的引物可用以檢測DNA樣品中是否含有豬牛 或羊來源的DNA成分。
圖2、為本發明外部引物檢測靈敏度分析結果電泳圖A為豬引物，B為牛引物，C為羊 引物。泳道l一6分別代表在200ng無關DNA中添加相應豬牛羊總DNA 100ng, 10ng， lng, 0. lng, 0. Olng， Ong作為模板的PCR擴增產物。
圖3、為本發明第二輪Nest-PCR擴增結果電泳圖A、 B、 C分別為豬牛羊二次nest-PCR 結果，泳道l, 2， 3， 4, 5， 6為梯度稀釋的DNA模板(加在200ng無關DNA中)，濃度分 別為lng， 0. lng， 10pg， lpg, 0. lpg, 0. Olpg;泳道7為PCR陰性對照，以無菌純水為模板。
圖4、為本發明巢式PCR檢測肝素原料中豬牛羊成分的結果電泳圖I:外部引物PCR擴 增結果，II: Nest-PCR擴增產物。A為豬引物，B為牛引物，C為羊引物。泳道l:豬牛羊陽 性模板；2:陰性對照；3 — 6: 4個肝素原料內提取的DNA。
具體實施方式
本發明的目的是為了公布一種基於分子分類學基礎上的豬、牛、羊來源肝 素的定性的檢測方法。發明人公布了一種可以用來PCR辨別肝素來源的特異性引物和反應體 系。下面就具體實施例來說明引物的特異性、檢測的靈敏度和肝素粗品檢驗來說明本發明的 具體運用。
實施例l、引物特異性、靈敏度的鑑定
1、 DNA的提取分別將新鮮豬肉、牛肉、羊肉研磨粉碎，DNA提取試劑盒(上海市農業 科學院和上海出入境檢驗檢疫局聯合研製)提取總DNA。核酸蛋白分析儀測量所提取DNA 樣品的OD260/OD280的值不小於1.5，並進行電泳檢測後，根據測得的濃度將DNA樣品 濃度稀釋到100ng/u1, -20'C保存。進行引物擴增靈敏度分析時將DNA IO倍梯度稀釋(102 —1(Tng/ul),再以稀釋的DNA為模板進行PCR擴增。
2、 擴增產物鑑定所有PCR擴增產物用296瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入終濃度為O. 5ug/ml 的溴化乙錠。電泳緩衝液為O. 5xTBE,以DL2000DNAMarker作為DNA分子量標準。電泳條 件為10V/cm電壓，電泳lh後在凝膠成像系統中拍照分析。
3、 引物特異性的鑑定以豬牛羊DNA (100 ng)為模板，分別用上述設計的豬牛羊特異 引物進行PCR擴增，結果豬引物只有豬成分DNA反應管有擴增，牛羊DNA均無擴增；同 樣，牛引物只能擴增牛成分，羊引物只能擴增羊成分，結果見圖l。
4、 巢式PCR第一輪擴增引物靈敏度分析分別在200ng不相關DNA中加入100ng到100pg 梯度稀釋的豬牛羊DNA作為模板，用上述相應的豬牛羊引物進行檢測，結果均有特異性擴 增，結果見圖2。
5、 巢式PCR第二輪擴增引物靈敏度分析將第一輪擴增產物稀釋100倍，再分別取lul 作為模板，用相應的內部引物進行第二輪擴增，結果，DNA模板量為l(Tiig時仍能有較強的 擴增。空白對照無擴增，表明PCR體系未受汙染。結果見圖3.
實施例2、肝素樣品來源的鑑定
分別將送檢4份肝素原料樣品(分別編號為3井、4#、 5井和6井)、新鮮豬肉、牛肉、羊肉研 磨粉碎，DNA提取試劑盒(上海市農業科學院和上海出入境檢驗檢疫局聯合研製)提取總 DNA。根據測得的濃度將DNA樣品濃度稀釋到100 ng/ul， -20'C保存。按照上述發明設計的 引物和PCR反應體系，進行PCR擴增鑑定送檢肝素樣品的來源。
將PCR擴增產物用296瓊脂糖凝膠電泳檢測鑑定可知在第一輪擴增後可以判斷5#和6#肝素 樣品為豬來源，而進行第二輪PCR擴增後可以斷定4份肝素樣品均為豬來源樣品，但3#樣品中 混有牛成分。結果見圖4。
權利要求
1、巢式PCR鑑定肝素豬、牛、羊來源的快速檢測方法，其特徵在於用DNA 提取試劑盒提取總DNA，進行巢式PCR擴增種特異性DNA序列基因，最 後電泳鑑定肝素來源。
2、 根據權利要求書l所述方法，其特徵為根據Genbank公布的豬、牛、羊線 粒體DNA序列，經同源性比對後，利用Primer5.0與Oligo 6軟體輔助設 計引物。具體如下(1)豬成分擴增引物名稱及序列第一輪擴增片段長度385 bpPl-5 5' -AAACATGAAACATTGGAGTAGTCC-3' Pl-3 5' - AGGATTAGTATTATAAATAAGGCTCC-3' 第二輪擴增片段長度80 bpP2-5: 5， TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3， P2-3: 5' -GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG-3，(2 )牛成分擴增引物名稱及序列第一輪擴增片段長度295 bpBov-mt F 5， TTTTAAGTTAGAGATTGAGAGCC-3， Bov-mt R 5， -AATAGTAGGCTTGGGAATAGTAC-3'第二輪擴增片段長度128 bp B2-5: 5' ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3' (3)羊成分擴增引物名稱及序列第一輪擴增片段長度319 bp Yang-mt F 5' -ATTTGCCTCTTTCATTACCCC-3' Yang-mt R 5' -TCCTGCTCATAAGGGATAGCC-3' 第二輪擴增片段長度112 bp S2-5: 5' -TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA-3' S2-3: 5' - TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
3、 一種穩定的巢式PCR反應體系，其特徵是根據權利要求2所述的引物，利用 本反應體系可以特異地鑑定肝素豬、牛、羊的成分來源。具體如下第一輪PCR反應體系及反應條件總反應體系為25ul，其中含DNA模板(100ng/ul) 1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul, 10XPCR緩衝液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚 合酶(5U/ul) 0.2ul，無菌超純水補足至25 ul。擴增反應條件為95'C 3 min， 95'C 40 s， 56'C 40 s， 72°C 40 s，共30個循環，最後72。C延伸10 min。 第二輪PCR反應體系及反應條件取第一輪反應產物稀釋100倍作為第二輪擴增的模板。 總反應體系為25ul，其中含DNA模板lul， dNTPs(10mM) 0. 2 ul， 10XPCR 緩衝液2.5 ul,內部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul,無菌超純水補足至25 ul。擴增反應條件為95°C 3 min， 95。C 20 s， 56。C 20 s， 72。C 20 s，共30個循環，最後72'C延伸10 min。
4、 一種檢測肝素的豬、牛、羊成分來源的PCR方法，其特徵在於它含有本發 明的特異性引物和PCR反應體系。
5、 一種檢測產品中豬、牛、羊成分來源的方法，其特徵在於該檢測方法是基於 權利要求書2和/或權利要求書3的。
全文摘要
本發明公開了一種可以鑑定肝素粗成品成分來源的檢測方法。引物及其反應體系。特徵是根據Genbank公布的豬、牛、羊線粒體DNA序列，經同源性比對後，利用Primer 5.0與Oligo 6軟體輔助設計得到引物，並建立了具體的穩定的巢式聚合酶鏈式反應(PCR)體系。經過具體實例驗證，經巢式PCR反應，本發明可以用來鑑定肝素粗品成分的豬、牛、羊來源，其基因含量靈敏度達到0.01pg，可以廣泛的運用到肝素粗成品檢驗中。本發明還可用於其它產品中豬、牛、羊的成分鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK101363058SQ200810123709
公開日2009年2月11日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者侯亞義, 王慶苓, 趙光鋒, 趙樹立, 黃亞紅 申請人:南京大學