一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法
2023-06-12 05:49:26
一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，主要步驟如下：（1）選取合適時期的花葯低溫預處理；（2）外植體表面消毒，接種；（3）高溫黑暗處理；（4）光照培養，誘導愈傷組織產生；（5）愈傷組織培養增殖；（6）愈傷組織分化不定芽；（7）芽苗轉接、植株擴繁與繼代培養；8）無根小苗生根成為完整植株。本方法獲得愈傷組織的機率高，愈傷組織分化頻率高，培養效果好。將本發明應用於茄子遺傳育種中，可以大大提高茄子花葯培養效率，豐富茄子優良基因型個體，完善茄子單倍體育種途徑，縮短育種周期，為加快茄子及其它茄科作物遺傳育種和花葯離體培養研究提供技術和理論依據。
【專利說明】一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物生物【技術領域】，具體涉及一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法。
【背景技術】
[0002]爺子(Solanummelongena Linn),屬於爺科(Solanaceae)爺屬(2n=2x=24),起源於亞洲東南亞熱帶地區，是歐洲、亞洲和北美洲的重要蔬菜品種之一。它不僅具有較高的營養價值，且食用方法多樣，是一種可以乾鮮結合、周年供應、經濟實惠的大宗蔬菜，深受廣大生產者和消費者的歡迎。中國是世界上最大的茄子生產國，因此，茄子的遺傳育種工作對於實際生產意義重大。
[0003]在茄子雜交育種工作中，自交系的選育是非常重要的工作，但往往存在選育周期長、選擇效率低等問題。單倍體育種可以大大提高後代選擇的效率，縮小育種群體規模，縮短育種年限，加快育種進程。
[0004]花葯離體培養是以花葯為外植體，通過無菌操作技術，接種在人工培養基上，誘導其分化出愈傷組織或胚狀體，隨後使愈傷組織分化成完整的植株。花葯培養不需要分離出花粉，程序比較簡化，因而是誘導人工單倍體的主要方法之一。
[0005]利用花葯培養可快速獲得純系和突變體，創新種質資源，對茄子遺傳育種及品種改良具有重要意義。70年代初，Riana等成功通過茄子花葯培養經愈傷組織途徑成苗。茄子不論是花葯還是花粉培養，都已有一些成功的報導。目前，有關茄子花葯培養的研究大多集中在如何提高愈傷組織和胚狀體的誘導頻率上.而對從愈傷組織誘導產生單倍體植株的研究則很少。許多愈傷組織不能正常的生長發育而只產生根，不分化芽，成苗率低。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於克服現有花葯培養技術中愈傷組織誘導率和分化率低，培養效果差的問題，是在於提供了一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，應用本方法獲得愈傷組織的機率高，愈傷組織分化頻率高，培養效果好。將本發明花葯培養方法及配套培養基應用於茄子遺傳育種中，可以大大提高了茄子花葯培養效率，豐富了茄子優良基因型個體，完善了茄子單倍體育種途徑，縮短了育種周期，為加快茄子遺傳育種和茄科作物花葯離體培養研究提供技術和理論依據。
[0007]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0008]一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，其步驟是:
[0009]I)從茄子花期開始，于晴天上午9:00-10:00從健壯植株上選取發育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處於單核中期至單核靠邊期的花蕾用於花葯培養，對應花蕾外部形態為花冠低於花萼裂基部至花冠高於花萼裂基部lmm-2mm，花葯為黃綠色；
[0010]2)將花蕾裝於自封袋內置於4°C -5°c冰箱預處理24h_72h ；
[0011]3)將花蕾外萼剝掉，再用75% (體積百分比)的酒精表面消毒28s_32s，之後用5%(質量百分比)的次氯酸鈉溶液消毒15min-20min，然後用無菌水衝洗3_4次；
[0012]4)在無菌濾紙上用鑷子剝取花葯，將花葯柄去除乾淨，接種於裝有愈傷組織誘導培養基的培養皿(90mm)中，每皿接種3-5個花蕾的花葯；
[0013]5)花葯接種後，置於35°C -37°C高溫黑暗條件下處理6d_7d ；
[0014]6)於光照強度15001x-20001x、光照時間12h_16h、溫度25°C _28°C下繼續培養，3周左右產生愈傷組織；
[0015]7)待愈傷組織長到直徑為時，切下並接種到愈傷組織增殖培養基上培養增殖；
[0016]8)兩周後，選取大小一致，色澤新鮮，淡黃色，質地緊密的愈傷組織轉移至愈傷組織分化培養基上，誘導不定芽發生；
[0017]9)待芽苗長至lcm-3cm長時，切下無根小苗，轉接到植株擴繁與繼代培養基上，每30d擴繁繼代一次；
[0018]10)根據育種需求和外界環境條件，在移栽大田前I個月將無根小苗轉移至生根培養基上，誘導生根，再生出完整植株。
[0019]上述步驟4)、7)、8)、9)、10)中培養基的組分及配比如下:
[0020]愈傷組織誘導培養基:1^基本培養基，0.511^/12，4-0，1.011^/1KT，8mg/L VC,30.0g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ；
[0021]愈傷組織增殖培養基:MS基本培養基，30.0g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的PH至5.8-6.0 ；
[0022]愈傷組織分化培養基:MS基本培養基，0.01mg/L NAA, 2.0mg/L ZT, 20.0g/L蔗糖，
7.5g/L瓊脂，加水至IL ;滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ；
[0023]植株擴繁和繼代培養基:MS基本培養基，0.01mg/L NAA, 2.0mg/L6_BA，20.0g/L蔗糖，7.0g/L 瓊脂，加水至 1L，ρΗ5.8-6.0
[0024]生根培養基:1/2MS (MS基本培養基大量元素減半)，0.2mg/L IBA，30.0g/L蔗糖，
7.0g/L瓊脂，加水至IL ;滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0。
[0025]所述的愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖培養基、愈傷組織分化培養基、植株擴繁和繼代培養基、生根培養基均在121°C，0.1-0.15Mpa下高溫高壓滅菌15_20min。
[0026]為了便於對本發明的理解， 申請人:對上述各個步驟中所用的培養基，培養基中所用到的植物激素做如下定義:
[0027]培養基包括愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖培養基、愈傷組織分化培養基、植株擴繁和繼代培養基和生根培養基。本發明所使用基本培養基為MS基本培養基(參見Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant, 1962, 15:473-497)。
[0028]本發明中，所述植物激素定義及簡稱如下:萘乙酸(NAA)、2，4_ 二氯苯氧乙酸(2、
4-D)、吲哚丁酸(IBA)，植物激素中的細胞分裂素包括激動素(KT)和玉米素(ZT)。
[0029]本發明與現有技術相比，具有以下優點和積極效果:
[0030](I)本發明是建立在對茄子花葯培養影響因素包括取蕾時期、溫度處理和培養基配方等系統研究工作基礎上的，從試驗材料選擇、培養到植株移栽大田以及田間表現的觀察，比較全面系統地說明了茄子花葯培養獲得單倍體植株的過程，方法簡便、易於操作。
[0031](2)與已有技術相比，本發明具有外植體不易褐化、愈傷組織誘導率和分化率高、培養效率高等優點，愈傷組織誘導率最高可達89.71%，愈傷組織分化不定芽率可達70.00%以上，不定芽成苗率達75%以上。
[0032](3)與已有技術相比，本發明設計愈傷組織增殖和植株擴繁步驟，愈傷組織增殖和植株擴繁效果好，提高了茄子花葯培養獲得單倍體植株的頻率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為本發明的一個實施例花葯培養選取花蕾的大小示意圖。
[0034]圖2為本發明的一個實施例剛接種的花葯示意圖。
[0035]圖3為本發明的一個實施例膨大的花葯示意圖。
[0036]圖4為本發明的一個實施例從花葯誘導產生的胚狀體直接再生植株示意圖。
[0037]圖5為本發明的一個實施例從茄子花葯誘導產生的愈傷組織示意圖。
[0038]圖6為本發明的一個實施例愈傷組織分化產生不定芽示意圖。
[0039]圖7為本發明的一個實施例一種不定芽再生出試管苗示意圖。
[0040]圖8為本發明的一個實施例試管苗生根示意圖。
[0041]圖9為本發明的一個實施例田間移栽成活的花培單倍體植株示意圖。
[0042]圖10為本發明的一個實施例供體二倍體植株和花培單倍體植株DNA流式分析圖。
`[0043]a供體二倍體植株DNA流式分析圖
[0044]b花培單倍體植株DNA流式分析圖
【具體實施方式】
[0045]實施例1:
[0046]—種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，其步驟是:(試驗材料選擇、培養基設計與接種培養)
[0047]1、試驗材料來源及其處理:
[0048]本發明的試驗材料選自茄子的花蕾，採自湖北省武漢市蔬菜科學研究所育種基地大棚，品種代號E83002，為日本雜交一代茄子品種。從茄子花期開始，于晴天上午9:00-10:00從健壯植株上取花蕾，選取發育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處於單核靠邊期的花蕾用於花葯培養，對應花蕾外部形態為花冠低於花萼裂基部至花冠高於花萼裂基部(見圖1)，花葯為黃綠色；將花蕾裝於自封袋內置於5°C冰箱預處理 24h。
[0049]2、培養基製備及設計:
[0050]表I列出了本發明的最佳培養基組成成分及其用量。
[0051]表I本發明設計的茄子花葯培養的最佳培養基
【權利要求】
1.一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，其步驟是: .1)從茄子花蕾發育期開始，于晴天上午9:00-10:00從植株上選取發育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處於單核中期至單核靠邊期的花蕾用於花葯培養，對應花蕾外部形態為花冠低於花萼裂基部1-2 mm至花冠高於花萼裂基部l_2mm，花葯為黃綠色； .2)將花蕾裝於自封袋內置於4-5°C冰箱預處理24-72 h； .3)將花蕾外萼剝掉，用75%體積百分比的酒精表面消毒28-32 S，之後用5%質量百分比的次氯酸鈉溶液消毒15 -20 min，然後用無菌水衝洗3_4次； .4)在無菌濾紙上用鑷子剝取花葯，將花葯柄去除乾淨，接種於裝有愈傷組織誘導培養基的培養皿中，每皿接種3-5個花蕾的花葯； .5)花葯接種後，置於35-37°C高溫黑暗條件下處理6-7 d ; .6)在光照強度1500-2000 lx、光照時間12 -16 h、溫度25-28 °C下繼續培養，3周產生愈傷組織； .7)待愈傷組織長到直徑為5-6 mm時，切下並接種到愈傷組織增殖培養基上培養增殖； .8)兩周後，選取大小一致，色澤新鮮，淡黃色，質地緊密的愈傷組織轉移至愈傷組織分化培養基上，誘導不定芽發生； .9)待芽苗長至1-3 cm長時，切下無根小苗，轉接到植株擴繁與繼代培養基上，每30 d擴繁繼代一次； .10)根據育種需求和外界環境條件，在移栽大田前I個月將無根小苗轉移至生根培養基上，誘導生根，再生出完整植株。
2.根據權利要求1所述的一種誘導茄子花葯再生單倍體植株的方法，其特徵在於: 所述的愈傷組織誘導培養基為:MS基本培養基，0.5 mg/L 2,4-D ,1.0 mg/L KT, 30.0g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ； 所述的愈傷組織增殖培養基為:MS基本培養基，30.0 g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至.1L,滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ； 所述的愈傷組織分化培養基為:MS基本培養基，0.01 mg/L NAA ,2.0 mg/L ZT, 20.0g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ； 所述的植株擴繁和繼代培養基為:MS基本培養基，0.01 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6_BA，.20.0 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的pH至5.8-6.0 ； 所述的生根培養基為:1/2MS，0.2 mg/L ΙΒΑ，30.0 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養基的PH至5.8-6.0。
【文檔編號】A01H4/00GK103444552SQ201310459357
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月28日 優先權日:2013年9月28日
【發明者】王春麗, 談太明, 徐長城, 黃樹蘋, 談傑, 張敏, 陳霞 申請人:武漢市蔬菜科學研究所