酶法水解酪蛋白的方法及水解產物的製作方法

2023-06-12 18:39:06

專利名稱：酶法水解酪蛋白的方法及水解產物的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種酶法水解酪蛋白的方法及水解產物，具體是關於一種利用複合酶技術水解酪蛋白以降低其過敏原含量的方法，以及根據該方法製備得到的水解產物。
背景技術：
牛乳是優秀的營養食品，蛋白含量為3.0% 3.5%，其中酪蛋白(CN)含量較高， 約佔總蛋白的80%。酪蛋白主要有as、β-、K-CN，牛乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為 80 20，而人乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為60 40，且人乳中不含a s-CN。由於牛乳與人乳中的蛋白組成不同，有很多人飲用了牛乳後會引起消化不良，甚至會產生過敏現象。眾所周知，自然界的蛋白質大多是由一條或者多條多肽鏈組成的，有的再與其它物質結合形成複合形式的蛋白質。在動物體的消化過程中，通過消化道中不同的蛋白水解酶將其分解成肽和胺基酸。肽的分子量一般在10000以下，分子量段在5000 10000之間的稱為大肽，分子量段在1000 180之間的稱為小肽、寡肽、低聚肽或稱為小分子活性多肽。從消化吸收的角度考慮，理想的酶解產物以寡肽含量較多為宜，即目標產物是分子量在 1000 180的肽。最早的嬰兒抗過敏食品是以乳酪蛋白為蛋白源，通過酶的處理將其水解為分子量在1000以下的肽和胺基酸的混合物，但是由於酶法水解過程很難按照人的設計去發展，酶解時並不是按照從大到小的順序去切割蛋白，所以有的水解物中有時游離胺基酸很高，而寡肽的含量卻很少。此外，研究表明，過敏原含量高低與分子量的大小並沒有直接的關係， 並非分子量越小，過敏原含量就低。目前在酶法水解酪蛋白的研究中，可以通過選擇合適的蛋白酶、控制酶解工藝條件等措施來實現不同的目的，比如降低水解產物的致敏性，獲得目標功能性肽等，使水解產物具有所期望的性能及組成。CN1011008027A公開了一種利用鹼性蛋白酶對牛乳酪蛋白進行水解製備磷酸肽和非磷酸肽的方法，以獲得功能性原料；CN1566152A公開了一種利用胰蛋白酶水解酪蛋白製備多種功能活性肽的方法；CN1105818A公開了一種利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶複合水解乳蛋白降低其抗原含量的方法，該方法水解底物為乳清蛋白和酪蛋白混合物，其中乳清蛋白佔到50%以上。孫浩等人在「鹼性蛋白酶對酪蛋白水解的最適宜條件」(《大連輕工業學報》，2003， Vol. 22, No. 1)中公開了以R)lin-酚法測定OD值間接表徵水解度，優化出鹼性蛋白酶水解酪蛋白最優工藝條件為水解溫度陽°0，？!1值為8.0，酪蛋白底物濃度為6%，鹼性蛋白酶與酪蛋白最適質量比為7% ；但是該正交實驗結果中並沒有包含最優方案，且未對其水解結果及水解物特徵進行詳細描述。孔芳等人對枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件進行了研究(「枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件研究」，《湖南農業科學》，2009，No. 6)，枯草桿菌鹼性蛋白酶 (Alacalase)是一種鹼性內切酶，能較專一切斷由芳香族胺基酸形成的肽鍵，而使芳香族胺基酸游離於肽鏈的末端。孔芳等人的研究是以水解度為指標得出水解優化工藝，並未描述其得到的水解產物的特性。唐寧等人採用胃蛋白酶、胰蛋白酶對嬰兒配方奶粉進行水解，通過動物實驗得出經過水解的樣品對小鼠的致敏作用均有所降低(「牛奶大分子蛋白的水解及其過敏原含量變化」，《中國臨床藥理學與治療學》，2004年第9卷第12期)；張嘉芷等採用胰蛋白酶水解法改性酪蛋白的研究中所得酪蛋白分子量分布與乳清蛋白接近，因此可推斷其寡肽含量並未達到50% ( 「酶法改性酪蛋白及嬰兒配方乳粉的研究」，《食品工業科技》，1997年第2期)。可以看出，目前酶解酪蛋白的研究主要集中在獲得功能性活性肽以及獲得較好的消化吸收效果等方面，而在深度水解酪蛋白並最大限度地降低其過敏原含量方面效果並不顯著。在現有的酶法水解蛋白的過程中，除非採用膜濾的方法除掉水解物中部分游離胺基酸或者除掉部分大分子未水解的部分來達到低分子量物質含量高、游離胺基酸含量低的效果，其他的方法很難平衡以下幾項1、水解度適中；2、寡肽含量高，吸收性好；3、過敏原含量低，致敏性低；4、游離胺基酸含量低，滲透壓低。

發明內容
本發明的一個目的在於提供一種酶法水解酪蛋白的方法，以使水解產物寡肽的含量較多，游離胺基酸含量較低，易於消化吸收，並最大限度地降低了過敏原含量。本發明的另一目的在於提供一種酶法水解酪蛋白的水解產物，其中寡肽含量高、 易於消化吸收，且具有低致敏性。一方面，本發明提供了一種酶法水解酪蛋白的方法，主要利用鹼性蛋白酶和胰蛋白酶複合使用，在保證最低的酶用量的前提下，可對酪蛋白進行深度水解，並最大限度地降低了水解產物中過敏原含量，使水解產物與未被水解的酪蛋白原料相比過敏原含量降低了 99%以上。本發明所提供的酶法水解酪蛋白的方法，主要包括步驟將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加鹼性蛋白酶進行水解，然後再添加胰蛋白酶進行水解，控制最終水解產物的水解程度為10% 20%。本發明中所用酪蛋白可以是通過本領域已知的方法得到的食品級酪蛋白，如酶凝酪蛋白、酸凝酪蛋白等。在本發明優選的實施方案中，可利用水，也可以利用緩衝溶液，優選利用緩衝溶液將酪蛋白溶解為5% 12% (w/w，按總固形物的含量計算)的蛋白溶液進行酶解，優選的酪蛋白溶液的濃度為8% 10% (除特別註明外，本發明中所述含量與比例均為重量含量與比例)。根據本發明的具體實施方案，本發明是採用微生物蛋白酶對酪蛋白進行水解，更具體地，所述蛋白酶包括鹼性蛋白酶和胰蛋白酶。這些蛋白酶均可商購獲得。在確定所用蛋白酶之後，適合蛋白酶水解的pH值範圍即可獲知。本發明中即可將欲進行酶解的酪蛋白溶液的PH值調節到適合所用蛋白酶水解的值，適合鹼性蛋白酶水解的PH值為8 10。調節pH值的調節劑可以採用所屬領域中常用的調節劑，如NaOH溶液、 HCl溶液等。將酪蛋白溶液調節至適合酶解的溫度，即可加入蛋白酶進行酶解。本發明中優選的酶解溫度為50°C 60°C。
向酪蛋白水溶液中加入的蛋白酶的量一般根據所用酶的活性和酪蛋白溶液的性狀來確定。本發明中，蛋白酶的活性以U(Unit)表示。一個U表示在最佳條件下，單位時間內(每分鐘)水解酪蛋白釋放出Ig酪氨酸所需要的酶量。根據本發明的具體實施方案，複合蛋白酶的總添加量為每IOOmL酪蛋白溶液中添加酶活單位為10000 20000U，優選的實施方案中，添加的複合酶為12000 15000U/100mL酪蛋白溶液。根據本發明的具體實施方案，本發明的方法中是採用鹼性蛋白酶和胰蛋白酶依次添加進行水解，具體是先用鹼性蛋白酶進行第一階段水解，而後加入胰蛋白酶共同進行第二階段水解。發明人在研究中發現，本發明所加入的複合酶中，鹼性蛋白酶添加量及水解時間佔優勢的情況下，酪蛋白溶液的抗原含量降低的更為顯著，同時水解後寡肽的含量也更多，利於消化吸收。根據本發明的優選實施方案，本發明中，鹼性蛋白酶與胰蛋白酶的添加比例為9 0.5 1(以酶活單位計)，優選為9 1 1，更優選為8 1 1。本發明中， 胰蛋白酶的添加可以縮短整個酶解反應時間，並有利於控制水解度在適中的範圍內。本發明以鹼性蛋白酶和胰蛋白酶單酶水解酪蛋白試驗結果為依據，以水解度作為第二階段胰蛋白酶的添加標準，發現當鹼性蛋白酶水解酪蛋白水解度控制在5% 10%左右時，再添加胰蛋白酶共同水解，此時水解效果最佳，抗原含量與酪蛋白原料相比降低了 99%以上，並且酶添加量最少。本發明最終控制水解度在10% 20%左右(最終水解度大於鹼性蛋白酶單獨水解階段的水解度)時，終止整個酶解過程。本發明在具體實施時，是先添加鹼性蛋白酶50°C 60°C進行水解1 4小時(達到水解度5% 10%的要求)，然後再添加胰蛋白酶50°C 60°C進一步水解1 4小時(達到水解度10% 20%的要求)，且控制兩個階段水解時間共2 5小時。 根據本發明的具體實施方案，複合蛋白酶優選控制水解度達到10 % 20 %時，熱滅活蛋白酶，終止酶解的進行。本發明中具體的熱滅活溫度為可控制為80°C 98°C，優選為85°C 95°C ；熱滅活時間5min 15min，優選為5min lOmin。滅活後迅速冷卻到室溫，即得到本發明的水解產物溶液，可將該水解產物溶液按照本領域的常規操作例如通過納濾膜進行脫鹽處理，最後通過噴霧乾燥技術將水解產物製成水解粉的形式。本發明中，採用高效液相色譜法對水解產物的分子量分布進行了測定。本發明的酪蛋白水解產物，其中分子量180 IOOODal的寡肽含量為50% 90%，游離胺基酸含量 < 5%，本發明的水解產物易於消化吸收。本發明中，水解產物的剩餘抗原含量用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確定。將未被水解的酪蛋白與特異性抗體結合，其濃度落入該試驗中確定的線性劑量-反應範圍內；水解產物製劑也類似的被結合，後續用酶標記物結合固定好的酪蛋白，添加TMB底物，根據顏色變化來判斷是否有抗原性可識別的酪蛋白存在。以質量為基礎將用水解產物得到的結果與用未被水解的酪蛋白原料得到的結果進行比較，然後計算水解產物的抗原性降低百分比。本發明水解產物的過敏原含量降低99%以上。在使水解產物具有良好吸收性的同時使其抗原性顯著降低正是本發明的優點之一。另一方面，本發明還提供了一種酪蛋白水解產物，其是按照本發明所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解產物。根據本發明的具體實施方案，本發明的酪蛋白水解產物中，分子量大於5000Dal的肽< 2%，分子量180 IOOODal的寡肽含量在50% 90%，分子量小於180Dal的游離胺基酸< 5% ；過敏原含量與酪蛋白原料相比降低至少99%。綜上所述，利用本發明的酶解方法，可使水解產物同時實現水解度適中，寡肽含量高，游離胺基酸低，致敏性低，易於消化吸收。
具體實施例方式本以下通過具體實施例詳細說明本發明的技術及特點，旨在幫助閱讀者更好地理解本發明的技術實質和所能產生的有益效果，不能理解為對本發明實施範圍的限定。實施例1將酪蛋白用水溶解配製成8%的酪蛋白溶液，並用氫氧化鈉將pH值調至8.0 ； 向上述酪蛋白溶液中加入鹼性蛋白酶，鹼性蛋白酶的添加量為9000U/ IOOmL酪蛋白溶液，在50°C下水解1. 0h後，水解度達到6. 98 % ；然後加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量為 lOOOU/lOOmL酪蛋白溶液，在50°C、胰蛋白酶與先前添加的鹼性蛋白酶共同作用下繼續水解1. 0h，然後在95°C水浴滅酶活lOmin，製得本實施例的水解物。對本實施例的水解物進行分析得出最終水解度達到11.23%，抗原含量由 577663ppm降低到^35ppm，過敏原含量與酪蛋白原料相比降低99%以上；水解物分子量分布結果如表1。表1酶解產物的分子量分布
權利要求
1.一種酶法水解酪蛋白的方法，該方法包括步驟將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加鹼性蛋白酶進行水解，然後再添加胰蛋白酶進行水解，控制最終水解產物的水解程度為10% 20%。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，鹼性蛋白酶和胰蛋白酶的總添加量為10000 20000U/100mL。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，鹼性蛋白酶與胰蛋白酶的添加比例為9 0. 5 1。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述酪蛋白溶液的濃度為5% 12%。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，先添加鹼性蛋白酶進行水解，當水解程度為 5% 10%時，再添加胰蛋白酶進行水解。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，水解初始pH值8.0 10. 0，先添加鹼性蛋白酶 50°C 60°C進行水解1 4小時，然後再添加胰蛋白酶50°C 60°C進行水解1 4小時， 且控制水解時間共2 5小時。
7.根據權利要求1所述的方法，該方法還包括熱滅活蛋白酶以終止水解的步驟；所述滅活溫度80°C 98°C，時間5min 15min。
8.根據權利要求1所述的方法，該方法包括步驟將酪蛋白溶解，配製5% 12%的酪蛋白溶液；將酪蛋白溶液的PH值調節到8. 0 10. 0 ；在50°C 60°C條件下，於酪蛋白溶液中添加鹼性蛋白酶進行水解1 4小時，待水解度達到5% 10%時，再向酶解液中添加胰蛋白酶進行複合酶水解1 4小時；當水解度達到要求時，熱滅活蛋白酶，滅活溫度為80°C 98°C，時間5min 15min。
9.一種酪蛋白水解產物，其是按照權利要求1 8中任意一項所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解產物。
10.根據權利要求9所述的酪蛋白水解產物，該水解產物中分子量大於5000Dal的肽 < 2%，分子量180 IOOODal的寡肽含量在50% 90%，分子量小於180Dal的游離胺基酸< 5% ；過敏原含量與酪蛋白原料相比降低至少99%。
全文摘要
本發明提供了一種酶法水解酪蛋白的方法，其中是利用複合酶技術水解酪蛋白降低其過敏原含量，所述的方法包括步驟將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加鹼性蛋白酶進行水解，然後再添加胰蛋白酶進行水解，控制最終水解產物的水解程度為10％～20％。本發明還提供了按照所述的方法製備得到的酪蛋白水解產物。按照本發明的方法所得酪蛋白水解產物中分子量在180～1000Dal的寡肽含量為50～90％，該水解產物吸收性好，且過敏原含量低，與原料相比過敏原含量降低99％以上。
文檔編號A23J3/34GK102379359SQ201010268478
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者雲戰友, 王彩雲, 石丹, 荊瑩 申請人:內蒙古伊利實業集團股份有限公司