對微囊藻毒素－lr進行化學修飾併合成完全抗原的方法

2023-06-19 08:25:01

專利名稱：對微囊藻毒素－lr進行化學修飾併合成完全抗原的方法
技術領域：
本發明屬於免疫檢測技術領域，特別涉及對微囊藻毒素-LR分子合成完全抗原的方法。
背景技術：
微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，簡稱MC-LR)是目前已知急性毒性最強、危害最大的一種淡水藍藻毒素。微囊藻毒素是一組環狀七肽，其中微囊藻毒素-LR的分子結構式如下 目前已經發現微囊藻毒素各種異構體有60多種，其變化主要在於第2位和第4位上2個L-胺基酸的不同，如MC-LR這2個位置上的胺基酸分別為亮氨酸和精氨酸(見上式中的序號2和4)。研究發現，第5位胺基酸Adda對微囊藻毒素的毒性是必需的，其共軛立體結構會影響其毒性，結構改變則毒性改變。
免疫檢測技術的關鍵在於獲得特異性和親和力良好的抗體，而抗體的這2個主要特性很大程度上取決於抗原的性質；微囊藻毒素-LR分子量為1000左右，本身不具備免疫原性，屬於半抗原，只有與大分子物質連接合成完全抗原才能促使機體產生免疫反應，從而獲得抗體。合成並純化免疫性能良好的MC-LR完全抗原是非常關鍵的技術環節。
一般來說，連接位點應選擇對免疫來說最不重要的區域，而將抗原決定簇基團(致毒基團)暴露在外面，因為抗體對遠離連接位點的基團的識別能力遠遠大於鄰近連接位點的基團的識別能力。
目前大多數研究(製備微囊藻毒素-LR的抗體)的連接位點都是選擇MC-LR第3位的D-MeAsp或第6位的D-Glu。利用其羧基只接與載體蛋白相連，不通過化學修飾。這樣帶來的後果是由此產生的抗體只能識別帶有Adda胺基酸的藻毒素，而不能將各種微囊藻毒素區別開來，從而不能很好的應用於免疫檢測。

發明內容
本發明的目的是為克服已有技術的不足之處，提出一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾併合成完全抗原的方法，本方法選擇第7位胺基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節球藻毒素；而且遠離兩個可變的胺基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發明提出的一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾併合成完全抗原的方法，包括對微囊藻毒素-LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分，所述對微囊藻毒素-LR的化學修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的鹼性碳酸鹽緩衝液中；混合均勻，在40℃～60℃反應1～2小時；2)反應完畢，降到室溫(20℃～30℃)，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產物H2N-etMC-LR；3)採用固相萃取技術對該中間產物進行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化後的中間產物溶於緩衝溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產物戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻後，按中間產物BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應12小時以上；6)反應完畢，混合物在PBS中透析24小時以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
上述採用固相萃取技術的純化方法，採用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，並用高純水調整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢後，用1～10％甲醇水溶液淋洗以淨化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹乾後，用甲醇(分為多次)將微囊藻毒素洗脫並收集。
本發明的特點及技術效果本方法選擇第7位胺基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節球藻毒素；而且遠離兩個可變的胺基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發明利用2-巰基乙胺在上述第7位胺基酸的雙鍵處引入1個氨基，通過它與載體蛋白連接；並通過SPE固相萃取技術來純化中間產物；通過MS測定產物的分子量從而鑑定修飾是否成功。
本發明偶聯劑的選擇在上述對MC-LR進行氨基修飾後(修飾產物)，用戊二醛作為偶聯劑，採用戊二醛一步法將MC-LR。戊二醛是一種雙功能偶聯試劑，能通過它兩端的醛基將2個自由氨基合成到一塊。通過戊二醛合成還可為多肽和載體蛋白之間提供一段非常靈活的長鏈，使它們之間有較大的空間，從而將半抗原充分暴露在外面，形成有利的免疫表位，進而達到良好的免疫效果。
具體實施例方式
實施例1首先進行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將0.5mg MC-LR溶於2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩衝液中；稱取60.4mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中。混合物充分搖勻，在40℃反應2小時；反應完畢，降到室溫20℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產物H2N-etMC-LR；採用固相萃取技術純化中間產物，材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge；再用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產物(含MC-LR約0.5mg)溶於3mL 0.01mol/LpH7.4的PBS中(預先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為5∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖，按MC-LR∶BSA摩爾比10∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩16小時；反應完畢，混合物在PBS中透析24小時，4℃，(8小時換一次，共3次；每次用PBS 2L)；上述採用固相萃取技術的純化方法，具體步驟如下活化用4mL甲醇活化，並用6mL高純水調整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢後，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以淨化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹乾後，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫並收集。
中間產物的鑑定採用MS儀測定主要產物的分子量。
MC-LR的修飾及純化結果對於修飾後的MC-LR，為了證實引進游離的巰基乙胺是否成功，本研究利用質譜儀MS測定目標產物(中間產物)的分子量。將2-巰基乙胺與MC-LR按照摩爾比3000∶1反應，固相萃取純化後，用甲醇洗脫，MS測定值為1072.7；主要產物的理論分子量為MC-LR與H2N-CH2CH2-SH的分子量之和，即1072.2，二者基本一致。結果表明，氨基修飾是成功的。對於合成抗原的鑑定，本實施例採用了紫外掃描技術。
對於合成抗原的鑑定，本實施例採用了紫外掃描技術。
合成完全抗原的定性分析對BSA，MC-LR及完全抗原的紫外掃描曲線顯示完全抗原和BSA同樣在280nm處有吸收峰；而238nm是MC-LR的吸收峰，完全抗原紫外掃描結果在238nm附近發生明顯的紅移，從而可以判斷，合成是有效的。
實施例2首先進行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將1.0mg MC-LR溶於2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩衝液中；稱取500mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中。混合物充分搖勻，在60℃反應1小時；反應完畢，降到室溫25℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止；用500mg 6ml C18BondElut cartridge純化中間產物；再來用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產物(含MC-LR約1.0mg)溶於3mL 0.01mol/L pH7.4的PBS中(預先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為15∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖；按MC-LR∶BSA摩爾比20∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩20小時；反應完畢，混合物在PBS中透析24小時，4℃。
對於合成抗原的鑑定採用多電荷生物質譜技術將所獲得的完全抗原純化、脫鹽後，利用API3000液相色譜質譜聯用儀測定的質譜圖顯示BSA分子量為66463.0，每連接上1個中間產物分子，分子量增加1000左右。從完全抗原的質譜圖可以發現，分子量分布從66000一直到73000，合成比在3～8之間的完全抗原是存在的，未參與合成的BSA信號較小。
權利要求
1.一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾併合成完全抗原的方法，包括對微囊藻毒素-LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；所述對微囊藻毒素-LR的化學修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的鹼性碳酸鹽緩衝液中；混合均勻，在40℃～60℃反應1～2小時；2)反應完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產物H2N-etMC-LR；3)採用固相萃取技術對該中間產物進行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化後的中間產物溶於緩衝溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產物∶戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻後，按中間產物∶BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應12小時以上；6)反應完畢，混合物在PBS中透析24小時以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
2.如權利要求1所述方法，其特徵在於，所述採用固相萃取技術的純化方法，採用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，並用高純水調整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢後，用1～10％甲醇水溶液淋洗以淨化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹乾後，用甲醇將微囊藻毒素洗脫並收集。
全文摘要
本發明涉及對微囊藻毒素－LR進行化學修飾併合成完全抗原的方法，屬於免疫檢測技術領域，包括對微囊藻毒素－LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；本方法選擇第7位胺基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節球藻毒素；而且遠離兩個可變的胺基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構體，可提高微囊藻毒素－LR抗體的特異性。
文檔編號G01N33/531GK1603827SQ20041009607
公開日2005年4月6日 申請日期2004年11月29日 優先權日2004年11月29日
發明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請人:清華大學