一種原位中途補加試劑的聚合酶鏈式反應方法
2023-06-11 21:39:46
專利名稱：一種原位中途補加試劑的聚合酶鏈式反應方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術，特別是涉及聚合酶鏈式反應方法。
背景技術：
聚合酶鏈式反應是一種體外擴增特定DNA的方法，經過25-35循環的擴增目標基因被放大100萬至1億倍，反應液的引物和四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)的克分子濃度至少需要是原始模板的100萬至1億倍。顯然，反應之初如此高飽和度的試劑不利於擴增的嚴謹性，而反應初期擴增的嚴謹性對擴增成功和形成專一擴增產物至關重要。反之，大幅度降低試劑的濃度雖有益於增強反應初期的嚴謹性，但必然造成反應過早進入飽和期使擴增產物達不到檢測的所需要的數量。在中途補加試劑是解決之道，但中途開啟反應管管蓋添加試劑既麻煩又容易造成滯後汙染，使中途添加試劑的方法難以實施。同様，崁套式PCR有許多優點，但需中途添加內套引物帶來諸多不便也容易造成滯後汙染。十幾年來雖然PCR新技術層出不窮但一次性配製反應試劑的常規至今沒有突破。本發明提供了一種簡單、有效的在閉管和原位條件下中途補加試劑的方法，使擴增的專一性得到顯著的、意想不到的改進，也使PCR技術有更多機會創造更簡便的檢測方法和更應泛的應用。
發明內容
所要解決的技術問題發明提供了一種簡單、有效的在中途閉管和原位條件下補加試劑的方法，從而克服了現行PCR技術需一次製備配齊試劑，反應前期相對飽和度太高影響擴增專一性等的缺陷。
發明構思大多數PCR擴增產物的解鏈溫度在80-90℃之間，G+C％較低、礆基排列合適、長度又較短的擴增產物的解鏈溫度甚至低達70℃左右，因而完成PCR擴增的最低允許變性溫度範圍為70-90℃，擴增的變性溫度不必局限於現行的94℃左右。另一方面Taq等耐熱性DNA聚合酶能耐受短時間98℃以上的高溫，若將擴增的一個循環或若干循環的變性溫度提高至98℃並不會導致酶的嚴重失活而影響擴增。所以，針對一個既定的擴增產物PCR循環的變性溫度有相當大的伸縮變化空間。如果預先將需要添加的一種或幾種試劑用一種不溶於水、化學反應惰性、比重小於水、融點在上述溫度範圍內的固體包埋起來覆蓋在反應液上，或者在PCR反應液上先加上這種已融化的固體，待凝固後再覆蓋需要添加的試劑與底層的反應液阻隔分開。控制PCR變性溫度高於擴增產物的解鏈溫度而低於所說的固體的融化溫度就能使試劑保持與反應液隔開。需要時只要提高反應的變性溫度至高於所說的固體的融化溫度，固體融化後原來被隔開的試劑就釋放到反應液中參與反應。本發明首選融點80-97℃、融化溫度區間2-5度的純的正烷TING或各種規格的微晶和合成石蠟混合物，也可使用具有類似特性、符合要求的其他化合物。
技術方案PCR反應液包括緩衝液、鎂離子、模板核酸、dNTPs、DNA聚合酶和引物等。PCR反應步驟依次包括(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；
(4)按步驟(1)-(3)循環進行合成反應；需要中途添加的試劑可預先用石蠟等包埋然後置於反應液上，或製備反應液後將已融化的石蠟迅速置於反應液上，凝固後再在石蠟上加需要在反應中途添加的試劑。添加試劑包括dNTPs、DNA聚合酶、引物、崁套PCR的內套引物、促進PCR反應的添加劑或其他需要在反應中途添加的試劑。添加的試劑可以是一種或同時添加幾種。添加的試劑也可以是在PCR反應完成後的檢測用或其他用途的試劑，如雙鏈DNA專一的SYBR錄I螢光檢測試劑。控制添加試劑的濃度和體積使試劑釋放到反應液後的終濃度達到預期的濃度。PCR反應開始控制首次變性溫度和隨後的5-25循環的循環的變性溫度高於擴增產物的解鏈溫度，但低於包埋或阻隔劑開始融化的溫度。優選變性溫度比擴增產物的解鏈溫度高2℃以上，比包埋或阻隔劑融化溫度下限低2℃以上。需要釋放試劑時控制該循環的變性溫度高於包埋或阻隔劑完全融化的溫度但低於99℃。優選變性溫度比包埋或阻隔劑融化溫度上限高2℃以上。添加試劑釋放到反應液之後的5-25個循環立即回復到原來的低變性溫度、保持若干循環高溫變性後再回復到原來的低變性溫度或繼續保持較高變性溫度直至反應結束。包埋或阻隔劑優選融點溫度符合要求的微晶石蠟或合成石蠟。
有益效果1，實現了閉管、原位中途添加試劑，既方便又消除了滯後汙染問題。
2，可大幅度降低PCR反應起始液的試劑濃度、增強反應嚴謹性。
3，可大幅度提高PCR反應後期反應液的試劑濃度、增強擴增產物形成。
4，應用於嵌套式PCR使引物設計和擴增程序設定簡化、操作方便。
5，PCR反應結束後添加檢測試劑可直接螢光檢測。
6，PCR反應結束後反應液上覆蓋有固體介質減少開管時氣流震蕩、擴散導致的滯後汙染。
具體實施實施例1實施例1目標基因為人beta-腎上腺素受體基因(美國國家生物信息中心基因庫編號M15169)。引物採用文獻報導(Xie，H.G和WAJ等Clin.Pharmacol.Ther，2000，67(6)，670-5，其順序和特性示於表1。正反引物在同一外顯子內，以基因組DNA為原始模板時擴增產物長252鹼基，擴增產物解鏈溫度90.1℃。試驗採用ClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒，DNA濃度1ug/100ul，引物濃度0.4uM，每管反應體積50微升。
表1，引物順序和特性
PCR初次變性92℃1分鐘，循環變性92℃30秒，退火50-68℃30秒，延伸68℃30秒。共35循環。結果示於表2。
表2，使用標準濃度dNTPs時的擴增結果
結果說明當退火溫度為55-67℃時能得到目標擴增產物但均有大量非專一擴增產物形成，退火溫度大於68℃時沒有非專一擴增產物但也沒有目標擴增產物形成。
實施例2實施例2目標基因和試劑等與實施例1相同，但反應液dNTPs濃度2nM是實施例1所用常規濃度的百分至一。在反應液上加50-100ul融點為94-96℃的石蠟，凝固後在石蠟上加5微升2mM的dNTPs。PCR初次變性，循環變性和延伸條件也與實施例1相同，但退火65℃1分鐘。進行不同循環後，將變性溫度提高到98℃維持2分鐘，再按上述條件繼續循環，對照組dNTPs濃度為常規的0.2mM，包埋顆粒內含5微升水。表3顯示擴增結果。
表3，不同循環時提高變性溫度融化石蠟的擴增結果
結果說明反應液初始dNTPs濃度低，在10-20循環時添加dNTPs均得到目標擴增產物而沒有非專一產物形成。
實施例3實施例3的方法與實施例2相同，反應液的初始dNTPs濃度0.1-200uM，在反應10循環後提高變性溫度融化石蠟。試驗結果示於表4。
表4，不同起始濃度dNTPs的擴增結果
結果說明試驗組初始dNTPs濃度為0.1-10uM，即常規濃度的二十分之一至二千分之一時均得到目標基因擴增產物而沒有非專一擴增形成。
實施例4實施例4目標基因為人beta肌動球蛋白(美國國家生物信息中心基因庫編BC016045)，引物順序和特性示於表。
表5，實施例4引物順序和特性
以cDNA為模板外套和內套擴增產物長分別為352和290礆基，擴增產物解鏈溫度分別為82.9和82.0℃。反應試劑和濃度與實施例2相同，dNTPs濃度為常規濃度0.2mM。所用石蠟融點為87-90℃。反應PCR初次變性85℃1分鐘，反應前15個循環變性85℃30秒，退火64℃30秒，延伸72℃30秒，然後將變性溫度提高到94℃維持2分鐘使內套引物進入反應液，後15個循環變性85℃30秒，退火和延伸72℃1分鐘。反應結束電泳分離螢光染色顯示專一的290礆基條帶。
實施例5實施例5目標基因、引物和反應程序均與實施例4相同。反應結束達室溫或4℃後開啟反應管在管壁加反應液十分之一體積、濃度為200倍稀釋的SYBR熒光錄I試劑，再放在基因擴增儀上將試管加熱至94℃，冷卻後取出反應管在紫外光下觀察到強烈螢光示陽性反應。負對照反應管不加様品DNA，反應結束後同様測定紫外光下未見熒光。
實施例6實施例6的目標基因為人第六染色體中一個基因片段。(美國國家生物信息中心基因庫編號GI29801752)。引物順序和特性示於表6表6，實施例6引物順序和特性
擴增產物長131鹼基，擴增產物解鏈溫度70.7℃。反應試劑與實施例2相同。反應液dNTPs濃度0.02uM為常規用量的十分之一。引物濃度為0.05uM也常規用量的十分之一。預先將5微升含2uMdNTPs和5uM引物的補加液包埋在融點為80-85℃的石蠟置於反應液上。初次變性75℃1分鐘，循環變75℃30秒，退火60℃30秒，延伸68℃30秒。反應10個循環後提高變性溫度至90℃維持一分鐘。然後恢復原先程序至35循環。反應結束後取樣電泳分離螢光染色顯示專一的131礆基條帶。
權利要求
1，一種以基因組DNA或cDNA為模板的聚合酶鏈式反應，至少一種完成擴增反應或完成擴增產物檢測所需的試劑置於反應液管內但被固體包埋或阻隔，不與反應液接觸。反應依次包括如下步驟(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環進行擴增反應；其特徵在於在反應中途或結束在不開管蓋和不移動反應管的前提下使所說的被固體包埋或阻隔的試劑與反應液接觸完成擴增反應或完成擴增產物檢測。
2，根據權利要求1所述的聚合酶鏈式反應所說的包埋或阻隔試劑的固體是不溶於水、化學反應惰性、比重小於水、融點80-97℃的化合物
3，根據權利要求1至2所述的聚合酶鏈式反應所說的包埋或阻隔試劑的固體是融點80-97℃的微晶石蠟和合成石蠟。
4，根據權利要求1至3所述的聚合酶鏈式反應前5-25循環的變性溫度低於所說的固體的融點，反應後5-25循環的變性溫度高於所說的固體的融點。
5，根據權利要求1至3所述的聚合酶鏈式反應的變性溫度低於所說的固體的融點，反應中途有1-5個循環變性溫度高於所說的固體的融點。
6，根據權利要求1至3所述的聚合酶鏈式反應的變性溫度低於所說的固體的融點，反應結束時加熱至高於所說的固體的融點。
7，根據權利要求1至5所述的聚合酶鏈式反應所說的中途添加的試劑是反應所需的至少四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)中的一種。
8，根據權利要求1至5所述的聚合酶鏈式反應所說的中途添加的試劑是反應所需的至少一個引物。
9，根據權利要求1至5和8所述的聚合酶鏈式反應所說的中途添加的試劑是嵌套式PCR反應的內套引物。
10，根據權利要求1至5所述的聚合酶鏈式反應所說的中途添加的試劑是反應所需的DNA聚合酶。
11，根據權利要求1至3和6所述的聚合酶鏈式反應所說的在反應結束添加的試劑是核酸螢光試劑，優選雙鏈DNA專一螢光試劑特別是SYBR錄I。
全文摘要
一種將擴增所需試劑成份的一部份用高融點微晶石蠟或有類似特性的固體包埋或阻隔的聚合酶鏈式反應方法。PCR前階段變性溫度低於石蠟的融點，被包埋或阻隔的試劑不參與反應，反應中途一個循環或反應後期的變性溫度高於石蠟的融點，被包埋或阻隔的試劑釋放到反應液中參與反應。中途釋放試劑可減少反應前期試劑濃度提高反應的嚴謹性，又可提高反應後期試劑濃度增強擴增，將螢光檢測試劑預加在管內在反應結束釋放則可完成終點閉管檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1804036SQ200510023299
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月13日 優先權日2005年1月13日
發明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 陳有容 申請人:徐定邦, 徐文慧