大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白的原核表達及多抗製備和應用的製作方法

2023-06-11 11:27:06 1

專利名稱：大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白的原核表達及多抗製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白、多克隆抗體的製備；同時還涉及一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白、多克隆抗體的製備方法；還涉及一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白、多克隆抗體的應用。
背景技術：
中國大鯛(Andrias davidianus)俗名「娃娃魚」,是現存個體最大的兩棲動物，屬於兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科。中國大鯢是我國珍貴特產，屬於國家二級保護動物。然而隨著其養殖規模的擴大以及集約化程度的提高大鯢病害越來越嚴重，已經成為制約大鯢產業健康發展的一個重要因素。近年來許多大鯢養殖場暴發了大鯢病毒性出血病，該病傳染性強、死亡率高達90%以上，給大鯢養殖業造成了巨大的經濟損失。其病原為大鯢虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus, GSIV),虹彩病毒的一個主要特徵是具有直徑為120-300nm 二十面體衣殼結構，由一種分子量約50kDa的主衣殼蛋白(major capsidprotein,MCP)構成，該結構蛋白佔病毒蛋白總量的40%-45% (ChincharV G，2005)。虹彩病毒的主衣殼蛋白不僅是病毒的抗原相關蛋白，並且在病毒的包裝和感染過程中發揮重要作用。因此GSIV-MCP基因的原核表達、多克隆抗體的製備將為GSIV現場快速檢測試劑盒的研製及大鯢病毒性出血病的防治奠定一定的基礎。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白基因與PET_32(a)原核表達載體融合表達的重組蛋白，簡稱為PET-GSIV-MCP。大鯢彩病毒主衣殼蛋白(majorcapsid protein, MCP),分子量約 50kDa,佔病毒蛋白總量的 40 -45 (ChincharV G,2005)，是虹彩病毒的抗原相關蛋白，在病毒的包裝和感染過程中發揮重要作用。本發明將MCP基因克隆到原核表達系統PET_32(a) (Novagen)中，可以方便的製備大量融合表達的重組蛋白。該重組蛋白帶有6xHis Tag,便於純化。經蛋白純化試劑盒處理後，為一種高純度的可溶性蛋白。該蛋白可以直接免疫實驗動物進行抗血清的製備，也可以直接免疫大鯢為大鯢提供免疫保護力。MCP基因具有高度的保守性，目前本實驗室已經對湖北、湖南、陝西、浙江等地的大鯢病毒進行了 MCP基因的擴增及序列比對，其相互之間MCP基因核苷酸序列的同源性高達99%以上。因此GSIV-MCP基因原核表達蛋白及多克隆抗體的製備對於全國各地GSIV的檢測及大鯢病毒性出血病的免疫防治提供了可能。本發明的另一個目的是在於提供了一種重組蛋白(PET-GSIV-MCP)的多克隆抗體。該多克隆抗體經ELISA效價檢測，具有滴度高，特異性強等特點。本發明的另一個目的是在於提供了一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白、多克隆抗體的製備方法。表達蛋白經過純化免疫紐西蘭大白兔，製備並純化了 PET-GSIV-MCP的多克 隆抗體。經ELISA效價檢測，製備的多克隆抗體具有滴度高，特異性強等特點。
本發明的再一個目的是在於提供了一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白的多克隆抗體在檢測GSIV中的應用。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施以EPC細胞(武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCCGDC0174)培養GSIV。病毒DNA提取試劑盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸為模板，PCR擴增得到GSIV-MCP基因。將GSIV-MCP基因克隆至原核表達載體PET-32 (a) (Novagen)，採用的載體PET-32 (a) (Novagen)含有6個His標籤，外源基因與載體融合表達，但不影響其免疫原性，因此製備的多克隆抗體特異性不受影響。重組表達載體PET-32(a)-MCP轉化至感受態細胞 E. coli.BL21(DE3) (Novagen)中，構建了重組菌株 PET-32 (a)-MCP/BL21，通過誘導表達條件(IPTG 濃度、時間)的優化，PET-32(a)-MCP 在 E. coli. BL21 (DE3) (Novagen)中得至Ij了高效表達。融合表達的重組蛋白經過簡單處理，經蛋白純化試劑盒(Promega, HisLinkSpin Protein Purification System)純化得到了高純度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新 西蘭大白兔，製備了 PET-GSIV-MCP的抗血清，抗血清經過抗體親和純化，得到純度較高的PET-GSIV-MCP的多克隆抗體。一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白、多克隆抗體的製備方法，其步驟是I)根據 GSIV-MCP 基因序列(GenBank accession number : JN615141. I),設計特異性引物PET-MCP-FP 5 ' -CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG-3 '含有 EcoRI 酶切位點；PET-MCP-RP :5' -CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3'含有HindIII 酶切位點。所述GSIV-MCP基因為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，經翻譯後為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。2)用EPC細胞(武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCCGDC0174)培養GSIV，病毒DNA提取試劑盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸為模板，進行PCR擴增。擴增產物經PCR產物及膠回收試劑盒(Promega, Wizard Sv Gel and PCR Cleanup System)回收純化。PCR 採用 50 y L 反應體系10 XPCR Buffer 5 u L, 10mmol/L dNTPI ii L，10 ii mol/L PET-MCP-FP 和 10 u mol/L PET-MCP-RP # I u L, 5U/ u L rTaq DNA 聚合酶0. 5uL, DNA模板為I u L，ddH20補足至50 u L ；PCR擴增程序為95°C預變性5min, 94°C變性lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個循環，72°C延伸 IOmin0 PCR 產物經 1.0% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR產物及膠回收試劑盒回收純化。其中大鯢虹彩病毒(GSIV)，其製備步驟是於T-25細胞培養瓶中接種EPC細胞，培養至匯合單層，棄去培養液，用無菌的Hank' s液洗滌細胞I次，取保存的細胞培養病毒液，以感染複數(Multiplicity of Infection，M0I)為5的量接種到細胞培養瓶中，加入適量的助感染劑Polybrene (終濃度10 u g/mL)，置於25°C培養箱中吸附lh，期間每20min輕輕往復傾斜培養瓶3-5次，以利於病毒均勻吸附。吸附完畢後，棄去病毒液，每瓶加人5mL細胞維持液(含2%血清的MEM培養基)，置於25°C培養箱中繼續培養，逐日觀察細胞病變情況。當細胞單層出現70% -80%細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)時，收穫細胞培養物，_80°C -室溫條件下凍融2次，於4°C條件下以4000r/min離心20min，棄去沉澱，病毒液分裝於凍存管中_80°C保存備用。3)將純化的PCR產物和PET-32 (a) (Novagen)分別用EcoRI和HindIII雙酶切，酶切產物經回收純化，用T4DNA連接酶進行連接，得到重組表達載體PET-32 (a) -MCP。4)重組表達載體PET-32 (a)-MCP轉化大腸桿菌感受態細胞E. coli. BL21(DE3)(Novagen)，PCR 篩選陽性菌株，得到重組菌株 PET-32 (a)-MCP/BL21，將 PET-32 (a)-MCP/BL21接種於LB液體培養基(含50 μ g/mL Amp)中，37°C 200r/min培養過夜。按I : 100的比例接種到新鮮LB液體培養基(含50 μ g/mL Amp)中，37。。200r/min至OD600為O. 4-0. 6，加入ImM IPTG誘導表達，然後進行SDS-PAGE分析。將誘導後的菌體進行超聲破碎處理，收集處理後的上清及沉澱，分別進行SDS-PAGE分析，以確定原核表達蛋白的表達形式。所述的E. coli.BL21(DE3) (Novagen)菌株是以T7RNA聚合酶為表達系統的高效外源基因的蛋白表達宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達受控於λ噬菌體DE3區的lacUV5啟動子，該區整合 於BL21的染色體上。該菌適合於非毒性蛋白的表達。所述重組菌株PET-32(a)-MCP/BL21可以LB培養基中快速増殖，在IPTG的誘導下高效表達目的蛋白。5)重組菌株 PET-32(a)-MCP/BL21，分別使用不同 IPTG 濃度(lmM、0. 5mM、0. ImM、OmM)及不同誘導時間(0h、2h、4h、6h、8h)進行誘導表達，以確定最佳的誘導表達條件。6)經過誘導的重組菌株PET-32 (a) -MCP/BL21經超聲波破碎處理，離心去上清，沉澱溶解在適量的磷酸鈉緩衝液(含8mol/L尿素)中,然後參照蛋白純化試劑盒(Promega,HisLink Spin Protein Purification System)對融合表達的重組蛋白進行純化。經Bradford法測定並調整蛋白的濃度為250μ g/ml。7)取純化後的重組蛋白2ml採用皮下多點注射法免疫紐西蘭大白兔(遺傳資源表見附件)(免疫前採集正常血清作為陰性對照)，以後每2周加強免疫一次，共4次。首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，後3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑。末次加強免疫7d後，心臟採血，分離血清。抗血清經抗體親和純化得到純化的PET-GSIV-MCP多克隆抗體，濃度為3mg/ml。8)純化的多克隆抗體，經ELISA法測定抗體效價大於I : 50000。 所述的MEM配方為
權利要求
1.一種大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白GSIV-MCP的原核表達、多克隆抗體的製備方法，其步驟是 1)根據GSIV-MCP基因序列，設計特異性引物 PET-MCP-FP :5'-CGGAAITCATGTCTTCTGTAACCG-3、含有I 酶切位點； PET-MCP-RP酶切位點； GSIV-MCP基因為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)用EPC細胞培養GSIV，病毒DNA提取試劑盒抽提病毒核酸為模板，進行PCR擴增，PCR採用 50 ii L 反應體系10 X PCR Buffer 5 u L, 10mmol/L dNTP I uL, Primers 10umol/L PET-MCP-FP 和 10 u mol/L PET-MCP-RP # I u L, 5U/ u L rTaq DNA 聚合酶 0. 5 u L, DNA 模板為I U L，ddH20補足至50 u L ;PCR擴增程序為95°C預變性5 min，94°C變性I min，55°C退火I min，72°C延伸I min，30個循環，72°C延伸10 min ；PCR產物經I. 0%w/v瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR產物及膠回收試劑盒回收純化； 3)將純化的PCR產物和PET-32(a)分別用EcoR I取HindIII雙酶切，酶切產物經回收純化，用T4 DNA連接酶進行連接，得到重組表達載體PET-32 (a) -MCP ； 4)重組表達載體PET-32(a)-MCP轉化大腸桿菌感受態細胞E. coli. BL21 (DE3)，PCR篩選陽性菌株，得到重組菌株PET-32 (a) -MCP/BL21，將PET-32 (a) -MCP/BL21接種於LB液體培養基中，37°C 200 r/min培養過夜；按I :100的比例接種到新鮮LB液體培養基中，37°C200 r/min至OD6tltl為0. 4-0. 6，加入ImM IPTG誘導表達，然後進行SDS-PAGE分析；將誘導後的菌體進行超聲破碎處理，收集處理後的上清及沉澱，分別進行SDS-PAGE分析，以確定原核表達蛋白的表達形式； 5)重組菌株PET-32(a)-MCP/BL21，分別使用不同 IPTG 濃度I mM、0. 5 mM、0. I mM、0mM及不同誘導時間0h、2h、4h、6h、8h進行誘導表達，以確定最佳的誘導表達條件； 6)經過誘導的重組菌株PET-32(a)-MCP/BL21經超聲波破碎處理，離心去上清，沉澱溶解在適量的磷酸鈉緩衝液中，然後參照蛋白純化試劑盒對融合表達的重組蛋白進行純化，經Bradford法測定並調整蛋白的濃度為250 u g/ml ； 7)取純化後的重組蛋白2ml採用皮下多點注射法免疫紐西蘭大白兔，並在免疫前採集正常血清作為陰性對照，以後每2周加強免疫一次，共4次；首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，後3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑，末次加強免疫7 d後,心臟米血，分離血清；抗血清經抗體親和純化得到純化的多克隆抗體，濃度為3mg/ml ； 8)純化的多克隆抗體，經ELISA法測定抗體效價大於I:50000。
2.權利要求I所述的一種GSIV-MCP基因原核表達蛋白的多克隆抗體在檢測GSIV中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白的原核表達及多抗製備和應用，其步驟是1)根據GSIV-MCP基因序列，設計引物；2)用EPC細胞培養GSIV，抽提病毒核酸為模板，PCR擴增；3)將純化的PCR產物插入到PET-32(a)，得到重組表達載體；4)重組表達載體轉化大腸桿菌感受態細胞，得到重組菌株；5)使用不同IPTG濃度及不同的誘導時間誘導重組菌株，獲得最佳誘導條件；6)經過誘導的重組菌株經超聲波破碎處理，經蛋白純化試劑盒純化，得到純化的重組蛋白；7)純化後的重組蛋白採用皮下多點注射法免疫紐西蘭大白兔，製備多克隆抗體。該多克隆抗體經ELISA效價檢測，具有滴度高，特異性強。為GSIV的快速檢測試劑盒及大鯢病毒性出血病的防治奠定基礎。
文檔編號C07K14/01GK102643835SQ20121013000
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者周勇, 孟彥, 張輝, 曾令兵, 高正勇 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所