一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發酵生產凝乳酶的方法

2023-06-11 05:34:11

專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發酵生產凝乳酶的方法
技術領域：
一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發酵生產凝乳酶的方法，具體的說是一種枯草芽孢 桿菌株，以及利用該菌株發酵生產凝乳酶的方法。本發明屬於微生物發酵技術領域。
背景技術：
凝乳酶是乳酪生產中的關鍵酶，它使原奶凝固分為兩個階段酪蛋白微膠粒中 α-酪蛋白和酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不會發生自發凝結，首先凝乳酶專一性的將 κ -酪蛋白分解為ρ- κ -酪蛋白和一種巨肽，使酪蛋白的微膠粒失去穩定性；然後在Ca2+作 用下ρ-Κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之間形成化學鍵從而形成沉澱。凝乳酶傳統上利用牛犢第四胃(皺胃)提取製作，隨著乳酪產業不斷擴大，單純靠 宰殺幼畜的方法來生產凝乳酶已經不能滿足現代工業對凝乳酶的需求。上世紀五十年代 以來，研究者一直努力尋求新的凝乳酶來源，目前除動物凝乳酶外，還有植物凝乳酶(無花 果樹液和菠蘿果實)和微生物凝乳酶(主要來源於真菌)。微生物的生長特性使得微生物 凝乳酶具有廣闊的發展前景，關於微生物凝乳酶的研究主要集中在黴菌如米黑毛黴(Mucor miehei)和微小毛黴(Mucor pusillus)的固態發酵產酶方面，而關於細菌液態發酵的研究 報導較少。與黴菌固體發酵相比，細菌液體發酵生產凝乳酶具有生長周期短、生產成本低、易 於控制生長條件等諸多優點，近幾年得到研究者更多的關注。但是，細菌生產的凝乳酶活性 和黴菌相比，還具有一定的差距。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有高產凝乳酶活性的枯草芽孢桿菌菌株，以及利用 該菌株液體發酵生產凝乳酶的方法。本發明的技術方案一株產凝乳酶的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)T，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :M2010259。用所述的枯草芽孢桿菌CCTCC NO =M 2010259發酵生產凝乳酶的方法，通過以下 步驟實現(1)斜面培養將枯草芽孢桿菌CCTCC NO =M 2010259接種於斜面培養基上，在 33°C下培養24小時；(2)種子培養將斜面長好的菌種接入種子培養基中，在33°C培養18 小時，搖床轉速150轉/分鐘；(3)液體發酵培養將培養好的種子接入發酵培養基中，接種 量為體積百分比0. 0.2%，在32 36°C培養96 136小時，搖床轉速150轉/分鐘； 發酵培養基組成，單位為克/升葡萄糖0 20，麩皮15 30，氯化鈉5，七水硫酸鎂5，磷 酸二氫鉀2，碳酸鈣3，用自來水配製，pH自然，121°C滅菌30min。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CCTCC NO :M 2010259篩選、分離與鑑定詳見 實施例1。上述技術方案中所述的斜面培養基為(單位為克/升)葡萄糖20，酵母膏10，瓊 脂20，用自來水配製，pH自然，115°C滅菌20min。
3
上述技術方案中所述的種子培養基為(單位為克/升)麩皮30，氯化鈉5，七水硫酸鎂5，磷酸二氫鉀2，碳酸鈣3，用自來水配製，pH自然，121°C滅菌30min。凝乳酶活力的測定用O.Olmol/L氯化鈣溶液配製質量濃度12%脫脂奶粉溶 液，室溫放置40min後使用，當天配製。取5mL 12 %的脫脂奶粉溶液在35°C水浴鍋中保 溫lOmin，加適量35°C預熱IOmin的酶液(發酵液5000rpm離心5min獲得之清液)，立 即搖勻，開始計時，把試管傾斜45°，旋轉試管，觀察壁上出現絮狀沉澱時為凝乳終點，記 錄凝乳時間。40min凝固ImL脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxhlet Unit, SU)。
權利要求
一株產凝乳酶的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)T，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM 2010259。
2.用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌CCTCCNO =M 2010259發酵生產凝乳酶的方法， 其特徵在於通過以下步驟實現(1)斜面培養將枯草芽孢桿菌CCTCCNO =M 2010259接種於斜面培養基上，在33°C下 培養24小時；(2)種子培養將斜面長好的菌種接入種子培養基中，在33°C培養18小時，搖床轉速 150轉/分鐘；(3)液體發酵培養將培養好的種子接入發酵培養基中，接種量為體積百分比 0. 1% 0. 2%，在32 36°C培養96 136小時，搖床轉速150轉/分鐘；發酵培養基組成，單位為克/升葡萄糖0 20，麩皮15 30，氯化鈉5，七水硫酸鎂5，磷 酸二氫鉀2，碳酸鈣3，pH自然，121°C滅菌30 min。
全文摘要
一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發酵生產凝乳酶的方法，屬於微生物發酵技術領域。本發明公開了一株產凝乳酶的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM2010259。應用該菌株通過液體發酵生產凝乳酶，步驟為(1)斜面培養；(2)種子培養；(3)液體發酵培養將培養好的種子接入發酵培養基中，接種量為0.1%~0.2%，在32~36℃培養96~136h，搖床轉速150rpm。本發明的優點在於枯草芽孢桿菌是常見的非致病菌，適合凝乳酶的生產；利用枯草芽孢桿菌CCTCCNOM2010259液體發酵生產凝乳酶具有產酶水平高，生產周期短，生產成本低，易於控制生長條件，酶提取方便等諸多優點，完全具有工業化生產的潛力。
文檔編號C12N9/56GK101993846SQ20101050416
公開日2011年3月30日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者丁明亮, 丁重陽, 張梁, 石貴陽, 顧正華, 黃博達 申請人:江南大學