一種小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法
2023-12-12 13:21:22 1
一種小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法
【專利摘要】本發明屬於經濟林的栽培方法，特別是涉及小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法。本發明採用胚芽誘導培養、初代芽誘導培養、芽增殖培養、壯苗培養、誘導生根培養，完成小葉紅豆的離體胚培養及植株再生培養，該培養方法擴繁係數較高，萌發時間短，增殖速度快，經壯苗培養，成苗移植後的成活率高，苗木健壯挺拔，長勢良好，對高效保育珍稀瀕危小葉紅豆資源具有重要的理論意義和較高經濟價值及開發利用前景。
【專利說明】一種小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於經濟林的栽培方法，特別是涉及小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法。
【背景技術】
[0002]小葉紅豆(Orfflosia micropylla')為蝶形花科紅豆樹屬 CrfflosiaG.Jacks.樹種，稀有種。小葉紅豆表現為衰退型，林下自然更新困難，自然繁衍能力、傳播擴散能力不強，隨著群落的發展與演替，將會被其他物種更替。小葉紅豆木材堅硬、材質優良，其邊材和心材區別明顯，邊材淺黃褐色，心材比例大，為深紫紅色至紫黑色，民間稱之為「紫檀木」，木材紋理通直，結構細勻，幹縮小，耐腐性強，色澤及花紋美觀，是製造高級家具、樂器、美術工藝品的特種珍貴用材，極為珍貴。分布於貴州、福建、廣東、廣西等地，生於海拔600-800m的山坡中。由於長期過度採伐，小葉紅豆目前數量存量稀少，為瀕臨滅絕物種，有關小葉紅豆種群及群落結構研究的資料較少，因而實施有效保護迫在眉睫。小葉紅豆材樹形高大幹直優美，是良好的風景觀賞樹種。現有技術中小葉紅豆自然資源少，成活率低，扁橢圓形種皮堅硬、蠟質、發芽不齊，有的種子在土壤中2年後才發芽，種子易遭鼠、鳥食；種子堅硬，種皮透水性差，種皮不易吸水萌發，必須經特殊催芽處理才能萌發，自然更新困難，自然繁衍能力、傳播擴散能力不強，因此開展優良單株的研究並採取組織培養無性繁殖技術，對培育優質苗和高效保育珍稀瀕危珍貴鄉土樹種小葉紅豆資源，調整林種樹種結構，促進林業可持續發展，為小葉紅豆遺傳改良、種苗繁殖技術、人工栽培技術、大樹遷地移植以及對珍貴樹種實施有效的保護與管理等研究工作提供技術支持，具有重要的理論意義和高經濟價值的開發利用前景。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法，該培養方法擴繁係數較高，萌發時間短，增殖速度快，經壯苗培養，成苗移植後的成活率高，苗木健壯挺拔，長勢良好，對高效保育珍稀瀕危小葉紅豆資源具有重要的理論意義和較高經濟價值及開發利用前
旦
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[0004]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
包括以下步驟:
1)取材方法:選取當年結實、籽粒飽滿的豆莢為材料，採摘後置3-5°C冰箱冷藏保存備
用；
2)培養基的配製:分別配製胚芽誘導培養基、初代芽誘導培養基、芽增殖培養基、壯苗培養基和生根培養基，這些培養基的PH值為5.7-5.9，培養基厚度為1.4~1.6 cm；所述胚芽誘導培養基:l/2MS+0.5-2.0mg ?L^BA+0.1-1.0mg ?L^IAA+0.1-0.3mg.Ι^ΝΑΑ+δ.0-7.0g? L_1Ag++18-22g.I^Su+l.0-1.5 g.L^1Ac,
所述初代芽誘導培養基:WPM +1.0-2.0mg ?L^BA+0.4-0.6mg ?L^KT+0.4-0.6mg.L4IM+0.4-0.6mg.L_1NAA+5.0-7.0g.L_1Ag++18-22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述芽增殖培養基:WPM+1.0-2.0mg ?L^BA+0.5-1.5mg ?L^KT+0.1-0.5mg ?L^TDZ+0.4-0.6mg.L-1NAA+ 5.0-7.0g.L-1Ag+ +18_22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述壯苗培養基:WPM+0.5-1.0mg ?L^BA+0.1-0.5mg ?L^KT+0.1-0.5mg ?L^NAA+0.5-1.0mg.L_1IAA+5.0-7.0g.L-1Ag+ +18_22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述生根培養基:l/2WPM+0.1-0.5mg.PNAA+0.5-1.5mg.IZ1IBA+5.0-7.0g.L_1Ag++18-22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L-1Ac ；
3)材料消毒處理:豆莢用自來水進行表面衝洗，置飽和漂白粉上清液中浸泡15-20min,用自來水滴衝1_1.5h後去除豆莢外殼，取出種子，用雙蒸水衝洗2_3遍，在超淨工作檯上用質量分數為75%酒精消毒20-40s，用質量分數為0.1%升汞消毒15-17min，無菌水衝3-4遍後，用消毒濾紙吸乾種子表面水分，放在滅過菌的培養皿上，去除位於生長點1/10部分堅硬種子外殼及蠟質層後接種於胚芽誘導培養基上；
4)胚芽誘導培養:100~150g胚芽誘導培養基接種種胚2-4個；所述胚芽誘導的培養條件:培養室溫度為23±2°C，前15~20天暗培養，後20~25天光照時間11-12 h/d，光照強度為1000~15001x ；
5)初代芽誘導培養:將經上述胚芽誘導培養，得到的生長良好的芽切成I~2cm長的帶腋芽莖段，接種在初代芽誘導培養基中進行誘導培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d， 光照強度為1500-20001x，誘導培養時間30~50天；
6)芽增殖培養:將經上述初代芽誘導培養，得到的生長良好的增殖芽切成I~2cm長的帶腋芽莖段，接種在芽增殖培養基中進行增殖培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d，光照強度為1500-20001x，增殖培養時間35~55天；
7)壯苗培養:將經上述芽增殖培養，得到高2-3cm完整的幼苗單株切下，接種在壯苗培養基中進行壯苗培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d，光照強度為1500-20001x，壯苗培養時間20~30天；
8)誘導生根培養:將經壯苗培養培養出來的帶有2-4片葉子、株高2-4cm的幼苗單株轉移到生根培養基中；所述生根培養的培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll-12h/d，光照強度為1500-20001x，生根培養時間25-35天；
9)試管苗完成:當試管苗長至2-4cm高，有3-5條形態正常的根，有4_6片葉子，葉長2-3cm時，完成小葉紅豆的離體胚培養及植株再生培養。
[0005]將所述步驟9)完成的試管苗進行移栽:將試管苗放在自然光下煉苗3-5天，再打開瓶蓋煉苗1-2天，用槍狀鑷把試管苗從培養瓶中逐漸取出並洗去附著在根部上的培養基，移入蛭石和腐殖土的質量比=1:2混合的基質中，用帶2個氣孔的玻璃罩罩住移栽試管苗，溫度控制在20-28 °C，溼度應保持在75% -85%。
[0006]本發明中培養基的配製:在基本培養基1/2MS，WPMU/2WPM中分別添加生長激素細胞分裂素(BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激動素(KT)、吲哚乙酸(IAA)中的幾種，分別配製成胚芽誘導培養基、初代芽誘導培養基、芽增殖培養基、壯苗培養基、生根培養基，所述這些培養基中再另外加入Su、Ag+，PH值:5.7-5.9，附加物為活性炭；培養基厚度為1.4~1.6 cm;基本培養基1/2 MS是指:MS中大量元素減半，其餘不變。基本培養基1/2 WPM是指:WPM中大量元素減半，其餘不變。[0007]為了得到小葉紅豆的胚芽誘導培養基，本發明以MS、l/2 MS為基本培養基，附加不同濃度的BA、NAA，以找出誘導效果最佳的配方，使用的培養基種類見表1。
[0008]表1培養基種類
【權利要求】
1.一種小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟: 1)取材方法:選取當年結實、籽粒飽滿的豆莢為材料，採摘後置3-5°C冰箱冷藏保存備用； 2)培養基的配製:分別配製胚芽誘導培養基、初代芽誘導培養基、芽增殖培養基、壯苗培養基和生根培養基，這些培養基的PH值為5.7-5.9，培養基厚度為1.4~1.6 cm；
所述胚芽誘導培養基:l/2MS+0.5-2.0mg ?L^BA+0.1-1.0mg ?L^IAA+0.1-0.3mg ^r1NM+5.0-7.0g.L_1Ag++18-22g.L^1Su+1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述初代芽誘導培養基:WPM +1.0-2.0mg ?L^BA+0.4-0.6mg ?L^KT+0.4-0.6mg.L4IM+0.4-0.6mg.L_1NAA+5.0-7.0g.L_1Ag++18-22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述芽增殖培養基:WPM+1.0-2.0mg ?L^BA+0.5-1.5mg ?L^KT+0.1-0.5mg ?L^TDZ+0.4-0.6mg.L-1NAA+ 5.0-7.0g.L-1Ag+ +18_22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac,
所述壯苗培養基:WPM+0.5-1.0mg ?L^BA+0.1-0.5mg ?L^KT+0.1-0.5mg ?L^NAA+0.5-1.0mg.L_1IAA+5.0-7.0g.L-1Ag+ +18_22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L^1Ac, 所述生根培養基:l/2WPM+0.1-0.5mg.PNAA+0.5-1.5mg.IZ1IBA+5.0-7.0g.L_1Ag++18-22g.L-1Su +1.0-1.5 g.L-1Ac ； 3)材料消毒處理:豆莢用自來水進行表面衝洗，置飽和漂白粉上清液中浸泡15-20min，用自來水滴衝1_1.5h後去除豆莢外殼，取出種子，用雙蒸水衝洗2_3遍，在超淨工作檯上用質量分數為75%酒`精消毒20-40s，用質量分數為0.1%升汞消毒15-17min，無菌水衝3-4遍後，用消毒濾紙吸乾種子表面水分，放在滅過菌的培養皿上，去除位於生長點1/10部分堅硬種子外殼及蠟質層後接種於胚芽誘導培養基上； 4)胚芽誘導培養:100~150g胚芽誘導培養基接種種胚2-4個；所述胚芽誘導的培養條件:培養室溫度為23±2°C，前15~20天暗培養，後20~25天光照時間11-12 h/d，光照強度為1000~15001x ； 5)初代芽誘導培養:將經上述胚芽誘導培養，得到的生長良好的芽切成I~2cm長的帶腋芽莖段，接種在初代芽誘導培養基中進行誘導培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d，光照強度為1500-20001x，誘導培養時間30~50天； 6)芽增殖培養:將經上述初代芽誘導培養，得到的生長良好的增殖芽切成I~2cm長的帶腋芽莖段，接種在芽增殖培養基中進行增殖培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d，光照強度為1500-20001x，增殖培養時間35~55天； 7)壯苗培養:將經上述芽增殖培養，得到高2-3cm完整的幼苗單株切下，接種在壯苗培養基中進行壯苗培養；培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll_12h/d，光照強度為1500-20001x，壯苗培養時間20~30天； 8)誘導生根培養:將經壯苗培養培養出來的帶有2-4片葉子、株高2-4cm的幼苗單株轉移到生根培養基中；所述生根培養的培養條件:培養室溫度為23±2°C，光照時間ll-12h/d，光照強度為1500-20001x，生根培養時間25-35天； 9)試管苗完成:當試管苗長至2-4cm高，有3-5條形態正常的根，有4_6片葉子，葉長2-3cm時，完成小葉紅豆的離體胚培養及植株再生培養。
2.根據權利要求1所述的小葉紅豆離體胚培養及植株再生方法，其特徵在於:將所述步驟9)完成的試管苗進行移栽:將試管苗放在自然光下煉苗3-5天，再打開瓶蓋煉苗1-2天，用槍狀鑷把試管苗從培養瓶中逐漸取出並洗去附著在根部上的培養基，移入蛭石和腐殖土的質量比=1:2混合的基質中，用帶2個氣孔的玻璃罩罩住移栽試管苗，溫度控制在20-28 °C，溼 度應保持在75% -85%。
【文檔編號】A01H4/00GK103688855SQ201310668368
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】何碧珠, 林蔚, 朱萍, 凌昌 申請人:福建農林大學