載體和試劑盒以及表面增強拉曼光譜分析方法

2023-12-11 18:23:52 4

專利名稱：載體和試劑盒以及表面增強拉曼光譜分析方法
技術領域：
本發明涉及一種載體以及包括所述載體的試劑盒，另外，本發明還涉及使用所述 載體進行表面增強拉曼光譜分析的方法以及所述載體的用途。
背景技術：
任何物質都是由一個或更多的化學成分組成。化學分析是分析單一或複雜的化合 物化學結構、組成和數量的方法和過程。因此化學分析在農業、製造業、商業貿易、醫療保健 和公共衛生以及人們的日常生活具有重要意義。因此，關於化學分析方面的研究進行得如 火如荼。拉曼光譜(RS)和紅外光譜(IR)同屬分子振動光譜，但它們的機理不同紅外光譜 是分子對紅外光的特徵吸收，而拉曼光譜則是分子對光的散射(即拉曼散射)。拉曼散射是 光子的非彈性散射。當光被原子或分子散射，其中大部分光子被彈性散射(瑞利散射)，這 種散射的光子與入射光的光子具有相同的能量(頻率)和波長。然而，一小部分散射光的 光子與入射光的光子具有不同的頻率，而且通常低於或高於入射光光子的頻率。由於拉曼 散射光的頻率位移對應於分子中電子的能態改變，因此拉曼光譜技術便成為人們研究分子 結構的新手段之一。20世紀40年代，由於當時的儀器技術水平所限，也由於紅外光譜技術 的迅速發展，拉曼光譜一度處於低潮階段。20世紀60年代初，雷射器的出現為拉曼光譜提 供了理想的光源，再加上計算機的發展，使雷射拉曼光譜逐步成為分子光譜學中的一個活 躍分支。表面增強拉曼光譜(SERS)是拉曼光譜分析技術的一種變體，是一種對金屬表面 敏感的技術。如果分子在位置上接近於特定金屬表面，由於分子和金屬的表面電子之間的 附加能量傳遞，拉曼信號的強度能夠被極大地增加，增強因子可高達IO14至1015，這使得該 技術可用於探測單個分子。為了進行SERS，所述分析物分子被吸附在納米級的粗糙金屬表 面上，以檢測到增強的拉曼散射。金和銀是典型的用於表面拉曼光譜增強的金屬，因為它們 的等離子體共振頻率位於可見光和近紅外輻射頻率範圍。金屬銅、鎳、鉬、鐵和鋁也可用於 表面增強拉曼散射。相比紅外光譜和螢光技術，表面增強拉曼光譜(SERS)可以提供豐富的分子結構 信息；相比質譜，SERS相對便宜、體積小。目前公知的使用表面增強拉曼光譜進行化學分析 的方法有兩種。第一種方法是以沒有液體吸收或不透水性的固體物質如金屬、陶瓷或玻璃 作為載體，將含有待測樣品和金屬納米顆粒的混合液置於該載體的表面上，然後用雷射拉 曼光譜儀進行檢測。此方法測量結果誤差較大，很難操作。第二種方法同樣以沒有液體吸 收或不透水性的固體物質如金屬、陶瓷或玻璃作為載體，不同的是首先將金屬納米材料固 定在該載體的表面上，然後將待測樣品的溶液置於有金屬納米顆粒的載體的表面上，並用 拉曼光譜儀進行分析。然而，此方法存在拉曼信號弱、靈敏度低的缺點。而且，在上述兩種 方法中檢測樣品在檢測過程是液體，且不能濃縮，從而導致拉曼信號較弱、靈敏度較低，因 此不能用於定量分析。

發明內容
本發明的目的是為了克服現有技術的表面增強拉曼光譜方法存在拉曼信號不穩 定、靈敏度低、操作困難和不能用於定量分析的缺陷，提供一種能夠使表面增強拉曼光譜分 析拉曼信號穩定、靈敏度高、操作便利且可進行定量分析的載體。本發明的另一目的是提供包括上述載體的試劑盒以及使用上述載體進行表面增 強拉曼光譜分析的方法。本發明提供了一種載體，其中，所述載體包括支撐體和至少一個分析單元，每個分 析單元包括除液結構、多孔基質層和增強層，多孔基質層和增強層位於除液結構之上，所述 除液結構位於所述支撐體中或位於所述支撐體表面上，所述增強層位於所述多孔基質層材 質表面上，所述除液結構用於接收來自多孔基質層的液體，所述增強層用於增強拉曼散射 強度。本發明還提供了一種試劑盒，其中，該方法包括將待測樣品的溶液負載到載體上， 然後測定待測樣品的拉曼光譜，其中，所述載體為本發明提供的載體，負載到載體上的方法 為將待測樣品的溶液加到所述載體的增強層上。本發明的發明人研究發現，雖然現有技術的第一種方法由於金屬納米顆粒的加入 而在一定程度上能夠增強拉曼散射信號，但是當用拉曼光譜儀分析待測樣品時，由於混合 液中的金屬納米顆粒下沉，使得金屬納米顆粒偏離拉曼光譜分析的雷射焦平面，因而拉曼 信號不穩定，且靈敏度很低。第二種方法雖然克服了由於金屬納米顆粒下沉而偏離雷射焦 平面的缺陷，但是在該方法中由於待測樣品處在溶液狀態和表面金屬納米顆粒不能有效地 混合，因而增強效應較低，導致拉曼信號的靈敏度低。本發明提供的載體結構簡單、操作方便且靈敏度高。使用本發明提供的載體進行 化學分析時，將樣品以溶液的形式滴在所述載體的多孔基質層上後，由於存在除液結構，因 而溶液中的溶劑能夠迅速被吸乾，待測樣品中的待測成分均勻附著在增強層的增強劑表面 上，具有濃縮和變液體樣品為固體樣品的特徵，從而可以直接用於分析，因而操作非常方 便。通過使待測樣品中的待測成分均勻附著在增強層的增強劑表面上，一方面避免了金屬 納米顆粒下沉而導致偏離雷射焦平面和拉曼信號不穩定的問題，另一方面還解決了現有技 術存在的待測樣品濃度低導致難於測試和拉曼信號很弱而無法進行定量分析的問題。而 且，使用本發明提供的載體，可以通過除液結構使大容量的液體樣品附著到小面積固體表 面上，並形成固體樣品層，再對該樣品層進行拉曼光譜分析便可顯著提高檢測的靈敏度。另 外，根據本發明提供的優選實施方式，通過加入內標物和外標物可以對待測樣品進行精確 的定量分析。


圖1表示本發明提供的載體的除液結構為吸液層時的縱截面示意圖；圖2表示本發明提供的載體的除液結構為孔道時的縱截面示意圖；圖3表示本發明提供的載體的除液結構為吸液層且所述載體還包括殼層的縱截 面示意圖；圖4表示本發明提供的載體的除液結構為孔道且所述載體還包括殼層的縱截面示意圖；圖5表示本發明提供的載體包括殼層時的俯視圖；圖6表示本發明提供的載體還包括濾膜的縱截面示意圖；圖7表示拉曼光譜儀結構示意圖；圖8表示實施例1中檢測得到的拉曼光譜圖；圖9表示實施例2中檢測得到的拉曼光譜圖；圖10表示對比例1中檢測得到的拉曼光譜圖；圖11表示實施例3的中藥劑未煎煮前、煎煮15分鐘、煎煮30分鐘、煎煮60分鐘、 煎煮90分鐘和煎煮120分鐘的測試結果圖。圖12表示根據實施例4的外標物待測樣品的拉曼光譜圖中在686CHT1處的散射峰 強度制定的標準曲線圖；圖13表示根據實施例5的測試樣品C1-C6的拉曼光譜中686CHT1處的散射峰強度 與730CHT1處的散射峰的強度的比值制定的標準曲線圖。
具體實施例方式以下結合圖1-6對本發明提供的載體作詳細地說明。如圖1-6所示，本發明提供的載體支撐體11和至少一個分析單元，每個分析單元 包括除液結構、多孔基質層12和增強層14，多孔基質層12和增強層14位於除液結構之上， 所述除液結構位於所述支撐體11中或位於所述支撐體11表面上，所述增強層14位於所述 多孔基質層12材質表面上，所述除液結構用於接收來自多孔基質層12的液體，所述增強層 14用於增強拉曼散射強度。所述支撐體11的材質可以是各種不影響測試的固體材料，例如可以是金屬、塑 料、玻璃或它們的複合材料。在本發明中，所述支撐體11的形狀和大小沒有特別的限定、 只要能夠放入拉曼散射儀中進行測試即可，例如，所述支撐體11可以為矩形薄片或圓形薄 片。所述支撐體11的面積可以為1-1000平方釐米，優選為10-100平方釐米。所述支撐體 11的厚度可以為0. 5-50毫米，優選為1-5毫米。在優選情況下，所述分析單元為多個，相鄰的2個分析單元互相間隔開，多個分析 單元可以共用一個除液結構，各個分析單元也可以具有單獨的除液結構，即相鄰的2個分 析單元的除液結構互相間隔開。在使用過程中，每個分析單元可以分別用於測量一個樣品， 因此分析單元的個數越多，能測量的樣品的個數也越多。進一步優選情況下，所述載體包括 兩排平行分布的分析單元，同一排分析單元的中心在同一條直線上，兩排相鄰的四個分析 單元的中心連線形成矩形或正方形。為了減少樣品之間的幹擾，相鄰兩個分析單元的多孔 基質層12最小距離為1-100毫米，所述最小距離是指相鄰兩個分析單元的邊緣的最小距 罔。在本發明的一種實施方式中，所述除液結構為吸液層13a，所述吸液層13a位於 支撐體11的表面。所述吸液層13a的吸液量優選為1-1000微升，進一步優選為1_100微 升。所述吸液層13a的材質為海綿、吸液性樹脂、纖維素紙、玻璃纖維或它們的結合。所述 吸液層的厚度為0. 1-10毫米，優選為0. 5-5毫米。所述吸液層的吸液率為0. 1-50，優選為 0.5-10，所述吸液率是指單位重量的吸液層能夠吸收液體的最大重量值。所述吸液層13a
5可以完全覆蓋所述支撐體11，也可以局部覆蓋所述支撐體11。具體地，在所述吸液層局部 覆蓋所述支撐體11的情況下，當本發明的載體包括一個分析單元時，所述吸液層13a為一 個面積遠小於支撐體的塊狀物；當本發明的載體包括兩個以上的分析單元時，所述吸液層 13b為兩個以上的不連續的塊狀物，所述不連續的塊狀物可以具有相同或不同的尺寸和形 狀，優選具有相同的尺寸和形狀。在本發明的另一種實施方式中，所述除液結構為位於支撐體11中的孔道13b。所 述孔道13b包括入口 13bl和出口 13b2，所述入口 13bl位於多孔基質層12的下方，來自多 孔基質層12的液體通過所述入口 13bl導入孔道13b中，並通過所述出口 13b2導出支撐體 11。當本發明提供的載體具有多個分析單元時，所述孔道13b包括多個入口 13bl，且每個入 口各自連接一個分析單元。另外，所述入口 13bl的橫截面積為其對應的分析單元的多孔基 質層12面積的0. 1-99%。另外，所述孔道13b與每個分析單元連接的入口的個數可以為多 個，當設置在每個分析單元正下方的入口數為多個時，各個入口的橫截面積之和與管道的 截面積均符合上述比例。在本發明的載體中，所述多孔基質層12用於聚集增強劑以形成增強層，並保證液 體能夠通過。所述多孔基質層12的上表面尺寸可以為10微米-10毫米，優選為0. 5-5毫 米，所述多孔基質層12的上表面可以為各種規則的形狀如圓形或正方形，當所述多孔基質 層12的上表面為圓形時，則所述上表面的尺寸是指圓形的直徑尺寸；當所述多孔基質層12 的上表面為長方形或正方形時，則所述上表面的尺寸是指正方形的對角線的尺寸。所述多 孔基質層12可以由各種多孔材料形成，所述多孔材料可以是有機聚合物、無機材料或者它 們的複合材料，例如可以是玻璃纖維、纖維素、尼龍、多孔矽、多孔玻璃、多孔金屬、多孔金屬 氧化物和矽納米結構材料中的一種或幾種。所述多孔金屬可以是貴金屬如金、銀，所述多孔 金屬氧化物可以是氧化鋁。所述多孔基質層12的厚度為0. 05-5毫米，優選為0. 1-0. 5毫米。所述多孔基質 層12的孔徑為10納米-10微米，優選為25-500納米，進一步優選為50-250納米，從而所述 多孔基質層12能夠截留顆粒大小大於該孔徑的固體顆粒。在上述優選的孔徑範圍內，一方 面能夠避免因孔徑太大而導致增強劑如金屬納米顆粒通過孔隙而難以形成增強層，並能夠 防止待測樣品中的待測成分通過孔隙而流失，另一方面還能使待測樣品中的溶劑如牛奶中 的水分快速通過孔隙進入除液結構中，使待測成分和增強劑迅速附著到多孔基質層12上， 形成待測樣品層。所述多孔基質層12的孔隙率為1-99%，優選為10-90%。在本發明中， 所述孔隙率是指孔隙的體積佔整個多孔基質層總體積的百分比。所述多孔基質層12可以為連續分布也可以為不連續分布。當所述載體的除液結 構為吸液層13a且所述吸液層13a完全覆蓋所述支撐體11時，所述多孔基質層12可以完 全覆蓋所述吸液層13a，也可以局部覆蓋所述吸液層13a ；另外，在所述載體包括多個分析 單元且所述吸液層13a為不連續分布的情況下，所述多孔基質層12優選為不連續分布並且 與所述吸液層13a對應。當所述載體的除液結構為孔道13b，並且所述載體包括多個分析單 元時，所述多孔基質層12優選為不連續分布並且與所述孔道的位置對應。在所述多孔基質 為不連續分布時，一方面可以節約多孔基質的用量，另一方面也能減輕整個載體的重量，從 而更便於攜帶。在本發明中，所述增強層14用於增強拉曼散射強度，所述增強層14的厚度為
60. 1-1000微米，優選為1-500微米。所述增強層14的厚度為從增強劑陷入多孔基質層12 內最深處至增強層14上表面最高點的高度。在所述增強層14中，起主要的增強效果的部 分是所述增強層14的上表面。所述增強層14可以通過各種常規的方法形成，例如，通過將 含有增強劑的溶液加到所述多孔基質層12上，所述多孔基質層12使所述溶液的液體通過 並截留固體顆粒，從而形成所述增強層14。所述增強劑包括金屬納米顆粒或者金屬納米顆 粒和能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質的混合物。在形成增強層以前，所述金屬納米顆粒和 能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質獨立保存。其中，至少50重量％的所述金屬納米顆粒的粒 徑為5-500納米，由於金屬納米顆粒的粒徑小，表面能高，因而在溶液中即使沒有所述能夠 使金屬納米顆粒凝聚的物質也能發生團聚，形成更大的顆粒，從而截留在多孔基質層12上 而形成增強層。所述金屬可以為金、銀、鎳、鉬、銅、鐵和鋁中的一種或幾種；所述能夠使金 屬納米顆粒凝聚的物質可以為鹽、酸和鹼中的一種或幾種，所述酸、鹼和鹽為能夠通過改變 金屬納米顆粒形成的金屬膠體微粒的Zeta電位(電子云的內外電位差)，從而實現金屬納 米顆粒的凝聚的鹽、酸和鹼中的一種或幾種。所述鹽可以為氯化物(如氯化鈉、氯化銨和氯 化鋰中的一種或幾種)、硝酸鹽(如硝酸銨、硝酸鈉和硝酸鉀中的一種或幾種)、硫酸鹽(如 硫酸鈉)或磷酸鹽(如磷酸氫二鉀)中的一種或幾種，所述酸可以為鹽酸、醋酸、檸檬酸中 的一種或幾種，所述鹼可以為氫氧化鈉或氫氧化氨。為了儘可能地防止測試樣品的拉曼光 譜信號被幹擾，所述能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質優選為氯化鈉和/或氯化鋰。在本發 明中，當所述增強劑為金屬納米顆粒和能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質的混合物時，所述 增強層14為在多孔層基質層12之上由金屬納米顆粒和能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質形 成的聚集物，形成聚集物的方法如下(1)製備所述金屬納米顆粒，所述金屬納米顆粒通常 以其液體或膠體形式使用。所述金屬納米顆粒液體通常是通過用已知的方法還原相應的含 金屬離子溶液中的金屬離子得到的金屬納米顆粒膠體溶液，形成的金屬納米顆粒液體可以 不經濃縮或稀釋而直接使用。含金屬離子溶液中的金屬離子濃度通常是在0. 01-10毫摩爾 /升(mM)，優選為0. 1-2毫摩爾/升。用於還原的還原劑可以為本領域技術人員公知的各 種還原劑。(2)把所述能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質添加到金屬納米顆粒液體中，得到 混合物液體，所述能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質的加入量使其在所述混合物液體中的最 終濃度為1毫摩爾/升至5摩爾/升；(3)把所述混合物液體添加到樣品孔中以形成增強 層14。在所述金屬納米顆粒液體中，在不存在稀釋、濃縮及溶劑揮發的情況下，金屬原子的 濃度可由金屬離子的濃度表示，所述金屬離子的濃度是指原來的金屬離子溶液與還原劑溶 液混合後但還原反應並未開始時的金屬離子的濃度。然而，由於金屬納米顆粒通常是由許 多金屬原子聚集得到的，而金屬納米顆粒的大小與溶液中金屬納米顆粒的濃度有關，在其 它條件相同的情況下，溶液中金屬納米顆粒的濃度越高，所得的金屬納米顆粒的粒徑越大， 溶液中金屬納米顆粒的濃度越低，所得的金屬納米顆粒的粒徑越小；而在金屬原子的總量 一定的情況下，金屬納米顆粒的粒徑越大，金屬納米顆粒的個數就越少，也即金屬納米顆粒 的濃度越低。由於金屬納米顆粒的數目和濃度測量不便，而在金屬原子的總量一定的情況 下，金屬納米顆粒的濃度又與金屬納米顆粒的粒徑有關，因此，一般不對金屬納米顆粒的數 目或濃度進行測量，而是通過金屬納米顆粒的粒徑來體現。本發明的發明人發現，相對於每 1平方毫米樣品孔的截面積，使用約20-35微升的至少50%的所述金屬納米顆粒的粒徑為 5-500納米的金屬納米顆粒液體即可有效實現本發明的目的。因此，優選情況下，相對於每1平方毫米樣品孔的截面積，使用約20-35微升的至少50%的所述金屬納米顆粒的粒徑為 5-500納米的金屬納米顆粒液體，例如，對於樣品孔直徑在0. 5毫米(約0. 2平方毫米)的 圓形樣品孔，使用4-7微升上述金屬納米顆粒液體。上述過程可在載體使用前完成或提前 完成並存放備用。在本發明的一種優選實施方式中，本發明提供的載體還包括殼層15，所述殼層15 固定在支撐體11上，所述殼層15與支撐體11的一個表面形成空間，分析單元位於該空間 內；所述殼層15包括開口 16，至少一個所述開口的對應於所述分析單元的位置。該開口 16 和位於該開口下的分析單元即構成用於承載拉曼分析樣品的樣品孔。所述殼層15可用於 將多孔基質層12以及吸液層13a固定在支撐體11上，並用於形成該載體的樣品孔。特別是 當所述載體包括上述多個分析單元時，所述殼層15能夠將不連續的增強層14、多孔基質層 12以及吸液層13a固定在支撐體11上，形成多個分析單元。通過殼層15的固定作用，所述 載體的各個部件之間無需粘合劑即可實現有效貼合。所述殼層15的材質可以是各種柔性 材質，例如可以是塑料片材或金屬箔如鋁箔、銅箔或金箔，所述殼層15的厚度可以為1-500 微米。當所述載體包括一個或多個分析單元時，所述分析單元位於所述開口 16的正下 方，分析單元的大小不小於所述開口 16的大小。在本發明中，所述殼層的開口 16的形狀和分析單元的截面的形狀可以相配也可 以不相配。優選情況下，所述殼層的開口 16和分析單元的截面(也即多孔基質層的截面) 的形狀均為圓形，所述開口 16的大小為1微米-10毫米，進一步優選為0. 1-5毫米，所述多 孔基質層的截面積優選為所述開口 16截面積的1.01-50倍，這樣即可保證待測樣品能夠 全部位於多孔基質層12上，還能夠使待測樣品充分濃縮。為了便於定量分析和進行多次檢 測，所述殼層的開口 16和分析單元的個數各自優選為2-12個。進一步優選情況下，所述載體還包括濾膜17，所述濾膜17覆蓋在所述殼層14的開 口 16上，所述濾膜用於截留大分子如蛋白質，所述濾膜的截留分子量為10000以上。所述 截留分子量是指能被濾膜截留住的溶質中最小溶質的分子量。所述濾膜17的材質可以為 再生纖維素、硝化纖維素或改性聚丙烯中空纖維，其厚度可以為1微米至0. 2毫米。所述濾 膜17的尺寸大於所述殼層14的開口 16的尺寸。本發明提供的載體的製作方法沒有特別的限定，只要能將增強層14、多孔基質層 12、吸液結構和支撐體11組合形成能夠用於盛放拉曼光譜分析用樣品的結構即可。例如， 當所述載體的除液結構為不連續的吸液層13a時，在支撐體11的一個表面上形成不連續的 吸液層13a，並相應在每個吸液層13a上附著多孔基質層12，然後將含有增強劑的混合液分 別加到所述多孔基質層12上，所述混合液中的液體通過所述多孔基質層12，從而形成增強 層14，再將具有開口且開口的形狀和位置與所述多孔基質層12相匹配的殼層15按照多孔 基質層12和吸液層13a的外形貼合附著到多孔基質層12或吸液層13a上，並固定在支撐 體11上。當所述載體的除液結構為孔道13b時，在支撐體11的支撐面上形成一個或多個 縱向的孔穴，孔穴的深度不貫穿支撐體11的厚度，然後通過橫向的孔穴與所述一個或多個 縱向的孔穴連通，且所述橫向的孔穴連通至支撐體11的外部，從而形成連通的孔道13b，然 後將多孔基質層12附著在縱向孔穴的入口上，然後將含有增強劑的混合液分別加到所述 多孔基質層12上，所述混合液中的液體通過所述多孔基質層12，從而形成增強層14，再將具有開口且開口的形狀和位置與所述多孔基質層12相匹配的殼層15按照多孔基質層12 的外形貼合附著到多孔基質層12上，並固定在支撐體11上。 本發明提供的載體在使用過程中可以使液體樣品濃縮成固體樣品以進行拉曼光 譜分析。所述載體在閒置的過程中(即使用之前)通常儲存在密閉環境中，所述密閉環境 通常為真空或填充惰性氣體如氮氣或氬氣，所述密閉環境由材質為玻璃、塑料、金屬等的材 料形成。在使用時，只需將樣品直接置於增強層14上即可，因此，操作非常便利。
本發明還提供了 一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括本發明提供的載體。本發明提 供的所述試劑盒可用於各種常規的化學分析如拉曼光譜分析。本發明提供的載體和試劑盒可以用於固體樣品分析，也可以用於液體樣品的分 析，但由於如上所述，在分析液體樣品時特別是分析液體樣品中的微量或痕量成分的含量 時更能體現本發明的優點，因此本發明以液體樣品的表面增強拉曼光譜分析方法為例說明 本發明的載體和使用該載體進行表面增強拉曼光譜分析的方法。本發明還提供了一種表面增強拉曼光譜分析方法，該方法包括將待測樣品的溶液 負載到載體上，然後測定待測樣品的拉曼光譜，其中，所述載體為本發明提供的載體，將待 測樣品的溶液負載到載體上的方法包括將待測樣品的溶液加到所述載體的增強層上。為了更有效地提高拉曼光譜的靈敏度，優選向待測樣品中加入能夠使金屬納米顆 粒凝聚的物質，然後將含有能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質的待測樣品加到所述載體的增 強層上。當所述載體還包括濾膜時，將待測樣品的溶液負載到載體上的方法包括待測樣品 的溶液加到所述載體的濾膜上，大分子物質截留在濾膜上，而小分子待測樣品和溶劑則通 過濾膜，溶劑通過增強層後繼續通過多孔基質層和除液結構而排出載體外，待測樣品則附 著在增強層上。在每一個直徑在0. 5毫米(約0. 2平方毫米)的圓形樣品孔分析單元中，所述含 待測樣品的溶液的用量一般為1-100微升，優選為10-20微升。根據本發明的一種優選實施方式，在所述混合液中還含有含量已知的內標物，所 述內標物為本身能產生拉曼光譜且該拉曼光譜不與待測物的拉曼光譜部分重疊或全部重 疊的物質。對於不同的待測樣品，內標物的種類可能不同。通過該優選方式，可以實現定量 分析。具體地，通過以含量已知的內標物的拉曼光譜信號為參照標準，將待測樣品的拉曼光 譜信號與參照標準進行比較，分析待測樣品的拉曼光譜特徵峰強度(縱坐標)與參照標準 的拉曼光譜特徵峰強度的比例或高度差，來判斷待測樣品的濃度(或含量)是高於還是低 於內標物的濃度(或含量)，甚至大致的濃度差(或含量差)。相對於每升的含待測樣品的混合液，內標物的用量一般為1微克-1克，優選為10 微克-100毫克。每個待測樣品內待測成分的絕對量可以在飛克(fg)至納克(ng)的範圍 內，甚至可以為單分子水平。也就是說，只要待測樣品中含有該待測成分，即便該待測成分 的含量為單個分子、飛克(fg)或者納克(ng)，採用本發明的方法也能測出。另外，為了實現定量分析，也可以包括將含量已知的外標物負載到所述載體上，然 後測定外標物的增強拉曼光譜，並將該外標物的拉曼光譜特徵峰與待測樣品的拉曼光譜特 徵峰進行比較，所述外標物與待測樣品具有相同或相似拉曼光譜特徵峰。上述使用外標物 的方法也可以稱為「外標法」。當使用外標法進行定量分析時，優選使用本發明提供的包括兩排樣品孔的載體。對於不同的待測樣品，外標物的種類可以不同。內標物和外標物可以相同，也可以 不同。採用拉曼光譜儀進行分析的方法為本領域技術人員公知的方法，例如，如圖7所 示，將承載有待測樣品的載體放置在工作檯21上，通過雷射器24發出雷射，經過光學過濾 器23並通過物鏡22形成聚焦光束，光束照射到待測樣品上產生拉曼散射，拉曼散射產生的 光信號通過光學信號檢測器25進行檢測，檢測到的光信號通過計算機26進行讀取和分析。本發明提供的表面增強拉曼光譜分析方法可用於對取自人體、動物、植物、微生 物、食物、藥物和環境等的樣品進行檢測。以下通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1本實施例用於說明本發明提供的載體以及使用該載體進行表面增強拉曼光譜分 析的方法。(1)製作載體將吸液層13a放置在支撐體11上，然後將多孔基質層12放置在所述吸液層13a 上，其中所述支撐體11為75毫米(長)X25毫米(寬)X2毫米(厚)的玻璃板，吸液層 13a的材質為厚度為0. 5毫米的纖維素紙(吸液率為5)，多孔基質層12的材質為孔徑為 200納米、孔隙率為50%和厚度為0. 5毫米的玻璃纖維膜。通過碾壓使它們相互緊密貼在 一起，然後在所述多孔基質層12上形成增強層14，所述增強層14通過將由5微升的銀納 米顆粒和5微升的濃度為5摩爾/升的氯化鋰組成的增強劑溶液滴加到玻璃纖維膜上而 形成，厚度為1微米。上述銀納米顆粒的顆粒直徑為40-80納米，具體的製備方法為向20 毫升的沸騰的濃度為1. 0毫摩爾/升的AgNO3的溶液中加入2毫升的1重量％的檸檬酸鈉 (Na3C6H5O7 · 2H20)溶液，並在磁力攪拌下維持回流沸騰10分鐘，即得22毫升的銀納米顆粒 膠體(即銀納米顆粒)。(2)檢測與分析使10微升的濃度為IOppm的三聚氰胺的水溶液加到所述載體上，在液體快速濾幹 並形成固體層之後進行拉曼光譜檢測，得到如圖8所示的拉曼光譜圖。在圖8中，在686CHT1 處的散射峰(686cm—1處散射峰為三聚氰胺的特徵峰)的拉曼強度為28365。實施例2本實施例用於說明本發明提供的載體以及使用該載體進行表面增強拉曼光譜分 析的方法。(1)製作載體以與實施例1相同的方法製作所述載體，不同的是，所述增強層14通過將由5微 升的銀納米顆粒(銀納米顆粒的粒子直徑為40-80納米，製備方法同實施例1)和2. 5微升 的濃度為5摩爾/升的氯化鋰組成的增強劑溶液滴加到玻璃纖維膜上而形成，厚度為0. 5 微米。(2)檢測與分析取10微升濃度為IOppm的三聚氰胺的水溶液與2. 5微升氯化鋰(5摩爾/升)混 合，並加到所述載體上，在液體快速濾幹並形成固體層之後進行拉曼光譜檢測，得到如圖9所示的拉曼光譜圖。在圖9中，在686CHT1處的散射峰(686CHT1處散射峰為三聚氰胺的特徵 峰)的拉曼強度為62370。以與實施例1不相同的是，氯化鋰(使能夠與金屬納米顆粒凝聚 的物質)分兩批加入。對比例1使10微升的濃度為IOppm的三聚氰胺的水溶液與5微升氯化鋰(5摩爾/升)和 5微升的銀納米顆粒(銀納米顆粒的粒子直徑為40-80納米，製備方法同實施例1)混合液 體，然後吸取10微升所述混合液體，並直接採用拉曼光譜儀對其進行拉曼光譜檢測以獲得 如圖10所示的拉曼光譜圖。在圖10中，在686cm-1處的散射峰(686CHT1處散射峰為三聚氰 胺的特徵峰)的拉曼強度為2463。通過將實施例1和2與對比例1的檢測結果進行對比說明，採用本發明提供的載 體可以使表面增強拉曼光譜靈敏度增強10倍以上。特別是當使能夠與金屬納米顆粒凝聚 的物質(如氯化鋰)分批加到所述載體上時，表面拉曼光譜靈敏度增強更加顯著，可以高達 20倍以上。實施例3本實施例用於說明本發明提供的載體以及使用該載體進行表面增強拉曼光譜分 析的方法和在中醫藥研究的應用。(1)製作如圖3所示的載體支撐體11為75毫米(長)X25毫米(寬)X2毫米(厚)的玻璃板，吸液層13a 的材質為厚度為0. 5毫米的纖維素紙(吸液率為5)，多孔基質層12的材質為孔徑為200納 米、孔隙率為50%和厚度為0. 5毫米的玻璃纖維膜，增強層14通過將由5微升的銀納米顆 粒(銀納米顆粒的粒子直徑為40-80納米，製備方法同實施例1)和5微升的濃度為5摩爾 /升的氯化鈉組成的增強劑溶液滴加到玻璃纖維膜上而形成，厚度為1微米，殼層15的材 質為厚度為0. 1毫米的鋁箔，樣品孔共12個(也即多孔基質和吸液層形成的分析單元的個 數為12)，沿該玻璃板長度方向排列成平行的兩排，兩排多孔基質層12之間的最小距離為1 毫米，相鄰兩個樣品孔的距離為9毫米，樣品孔為直徑為0. 5毫米的圓形孔。(2)待測樣品的製備對由5克枸杞、5克黃芪、10克黨參、3克當歸、7克首烏、10克淮山、8克茯苓、3克 杜仲和5克山茱萸組成的中藥藥方進行煎煮，分別取煎煮0分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、 90分鐘和120分鐘時的煎煮所得的1毫升液體作為待測樣品1、2、3、4、5和6。(3)拉曼光譜檢測將上述待測樣品1-6各自重複一次，並分別取10微升，並各自相應地加到上述(1) 所得的載體的12個樣品孔中。在各個樣品孔中的液體快速濾幹並在增強層上快速形成黑 色固體層之後，依次進行拉曼光譜檢測，待測樣品1-6的每個樣品中其一檢測結果示於圖 11中。(4)結果分析如圖11所示，內標物在720cm—1處的位置出現散射峰，該峰的強度最強，1320cm—1 位置處的散射單峰隨著煎煮時間而逐漸減弱，並且在煎煮30分鐘時該單峰在UOOcnT1處衍 生一肩峰，leoo-iesocnT1位置處的散射雙峰在煎煮30分鐘時出現並達到最強，而煎煮90分 鍾時該峰的強度大大減弱。由此可見，上述中藥藥方煎煮後得到的藥汁的化學成分會隨著
11煎煮時間的變化而改變，且由於在煎煮30-60分鐘時測得的拉曼光譜信息最多，表明所述 中藥藥方在煎煮30-60分鐘時所得藥汁中的化學成分信息最豐富。實施例4本實施例用於說明本發明提供的載體以及使用該載體進行表面增強拉曼光譜分 析的方法。(1)製作如圖6所示的載體支撐體11為80毫米(長)X30毫米(寬)X5毫米(厚)的塑料板，孔道13b的 孔徑為1. 0毫米，多孔基質層12的材質為孔徑為1微米、孔隙率為20%和厚度為3毫米的 玻璃纖維膜，增強層14通過將由5微升0. 1摩爾的鹽酸溶液和5微升金納米顆粒(金納米 顆粒的顆粒直徑為40-80納米，具體的製備方法包括向20毫升的沸騰的濃度為1. 0毫摩爾 /升的HAuCl4的溶液中加入2毫升的1重量％的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液，並在磁 力攪拌下維持回流沸騰10分鐘，即得22毫升金納米顆粒膠體(即金納米顆粒)，並使用所 需的量進行測試)組成的增強劑溶液滴加到玻璃纖維膜上而形成，厚度為1微米，殼層15 的材質為厚度為0. 15毫米的層壓塑料片材，樣品孔共12個(也即多孔基質形成的分析單 元的個數為12)，沿該塑料板長度方向排列成平行的兩排，兩排之間的間距為20毫米，同一 排的相鄰兩個樣品孔的間距為10毫米，樣品孔為直徑為1毫米的圓形孔。樣品孔頂部放有 直徑為3毫米、厚度為10微米的再生纖維素膜(截留分子量為10000以上)。(2)外標物測試樣品的製備分別將0微克、5微克、20微克、50微克、100微克和200微克的三聚氰胺加到10 克(10毫升)的不含三聚氰胺的胺基酸營養液(由廈門集仁生物科技有限公司生產)中， 製得0ppm、0. 5ppm、2ppm、5ppm、IOppm和20ppm的三聚氰胺外標物測試樣品，將如此製得的 樣品作為外標物測試樣品。(3)待測樣品的製備取三聚氰胺的含量未知的兩種胺基酸營養液待測樣品(A和B)，使用不含三聚氰 胺的胺基酸營養液樣品將待測樣品的濃度各自稀釋至1/2、1/10和1/100 ；從而得到6個樣 品A1、A2、A3、B1、B2和B3，如下表1所示，表 1
樣品稀釋程度Al1/2A21/10A31/100Bl1/2B21/10
1權利要求
一種載體，其特徵在於，所述載體包括支撐體(11)和至少一個分析單元，每個分析單元包括除液結構、多孔基質層(12)和增強層(14)，多孔基質層(12)和增強層(14)位於除液結構之上，所述除液結構位於所述支撐體(11)中或位於所述支撐體(11)表面上，所述增強層(14)位於所述多孔基質層(12)表面上，所述除液結構用於接收來自多孔基質層(12)的液體，所述增強層(14)用於增強拉曼散射強度。
2.根據權利要求1所述的載體，其中，所述分析單元為多個，相鄰的2個分析單元的增 強層(14)和多孔基質層(12)互相間隔開，多個分析單元共用一個除液結構或各個分析單 元具有單獨的除液結構。
3.根據權利要求1或2所述的載體，其中，所述除液結構為吸液層(13a)，所述吸液層 (13a)位於支撐體(11)的表面。
4.根據權利要求3所述的載體，其中，所述吸液層(13a)的吸液量至少為1-1000微升， 所述吸液層(13a)的厚度為0. 1-10毫米，所述吸液層(13a)的吸液率為0. 1_10。
5.根據權利要求1或2所述的載體，其中，所述除液結構為位於支撐體(11)中的孔道 (13b)。
6.根據權利要求5所述的載體，其中，所述孔道(13b)包括入口(13bl)和出口(13b2)， 所述入口(13bl)位於多孔基質層(12)的下方，來自多孔基質層(12)的液體通過所述入口 (13bl)導入孔道(13b)中，並通過所述出口 (13b2)導出支撐體(11)。
7.根據權利要求1或2所述的載體，其中，所述增強層(14)的厚度為0.1-1000微米。
8.根據權利要求7所述的載體，其中，所述增強層(14)由增強劑形成。
9.根據權利要求8所述的載體，其中，所述增強劑包括金屬納米顆粒或者獨立保存的 金屬納米顆粒和能夠使金屬納米顆粒凝聚的物質。
10.根據權利要求9所述的載體，其中，至少50重量％的所述金屬納米顆粒的粒徑為 5-500內米，所述金屬為金、銀、銅、鎳、鉬、鐵和鋁中的一種或幾種；所述能夠使金屬納米顆 粒凝集的物質為酸、鹼和鹽中的一種或幾種。
11.根據權利要求1或2所述的載體，其中，所述載體還包括殼層(15)，所述殼層(15) 固定在支撐體(11)上，所述殼層(15)與支撐體(11)的一個表面形成空間，分析單元位於 該空間內；所述殼層(15)包括開口(16)，至少一個所述開口對應於所述分析單元的位置。
12.根據權利要求11所述的載體，其中，所述載體還包括濾膜(17)，所述濾膜(17)覆 蓋在所述殼層(15)的開口(16)上，所述濾膜的截留分子量為10000以上。
13.—種試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括權利要求1-12中任意一項所述的載體。
14.一種表面增強拉曼光譜分析方法，該方法包括將待測樣品的溶液負載到載體上，然 後測定待測樣品的拉曼光譜，其特徵在於，所述載體為權利要求1-12中任意一項所述的載 體，負載到載體上的方法為將含有待測樣品的溶液加到所述載體的增強層上。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述混合液中還含有含量已知的內標物，所述 內標物為本身能產生拉曼光譜且該拉曼光譜不與待測物的拉曼光譜部分重疊或全部重疊 的物質。
16.根據權利要求14所述的方法，其中，該方法還包括將含量已知的外標物負載到所 述載體上，然後測定外標物的拉曼光譜，並將該外標物的拉曼光譜與待測樣品的拉曼光譜 進行比較，所述外標物與待測樣品具有相同或相似拉曼光譜特徵峰。
全文摘要
本發明提供了一種載體，其中，所述載體包括支撐體(11)和至少一個分析單元，每個分析單元包括除液結構、多孔基質層(12)和增強層(14)，多孔基質層(12)和增強層(14)位於除液結構之上，所述除液結構位於所述支撐體(11)中或位於所述支撐體(11)表面上，所述增強層(14)位於所述多孔基質層(12)表面上，所述除液結構用於接收來自多孔基質層(12)的液體，所述增強層(14)用於增強拉曼散射強度。本發明還提供了含有所述載體的試劑盒以及使用所述載體進行表面增強拉曼光譜分析的方法。本發明提供的載體能夠使拉曼散射信號得到明顯增強，從而靈敏度很高，而且還可以通過加入內標物或外標物進行定量分析。
文檔編號G01N21/65GK101936906SQ200910086778
公開日2011年1月5日 申請日期2009年6月30日 優先權日2009年6月30日
發明者趙珂 申請人:北京盈灃財智投資諮詢有限公司;北京中科泛華測控技術有限公司