一種槐角苷的藥物用途的製作方法

2023-07-09 16:09:31

本發明是涉及一種槐角苷的新藥物用途，屬於醫藥技術領域。

背景技術：

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)是由肝細胞內脂肪蓄積過多所致的常見肝臟疾病，當肝組織中脂類含量超過肝溼重的10％～15％，或在組織學上超過50％的肝細胞出現脂肪浸潤，即可診斷為脂肪肝。最近的研究表明：脂肪肝人群中的發病率約為1.85～5.2％/年，成年人中高達8.9～23.1％患有nafld。nafld是一個慢性的持續發展過程，可從單純性脂肪肝向脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化等病理過程發展，並且與胰島素抵抗、高血脂、動脈粥樣硬化、內皮功能障礙和冠心病等心血管疾病的發生密切相關並相互影響。目前用於治療脂肪肝的藥物包括胰島素增敏劑、降脂藥、減肥藥、抗氧化藥物及熊去氧膽酸等。維生素e作為抗氧化劑也用於脂肪肝的防治，為美國fda推薦的唯一脂肪肝藥物。可是至今包括維生素e、二甲雙胍等藥物均沒有被臨床證明有改善脂肪肝病人肝功能和脂肪樣變的作用。因此，臨床急需安全有效的治療nafld的藥物。

肝x受體(1iverxreceptors，lxr)包括lxrα和lxrβ兩種同源亞型，是配體激活的核受體轉錄因子超家族成員。研究表明：lxrβ廣泛表達於各組織器官；lxrs作為一種配體激活轉錄因子，調節下遊靶基因的表達，影響機體膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、脂肪酸代謝等許多生理功能；lxr的配體結合域可以與多種化合物結合，並調控其激活轉錄活性，因此lxr為理想的藥物靶點；利用特異性配體調節lxr轉錄功能，可能達到調節細胞內糖脂代謝平衡而治療高脂血症、動脈粥樣硬化、糖尿病等代謝性疾病。

目前研究較多的lxr配體多為lxrα和lxrβ的雙重激動劑，如t0901317和gw3965，動物實驗證明：這些配體具有顯著的降低血清膽固醇作用，但同時也促進肝臟脂肪酸合成，從而增加血清和肝臟甘油三酯含量，增大肝臟體積，會造成嚴重脂肪肝；因此，開發lxr拮抗劑或組織特異激動劑成為了當今醫藥研究的目標。

槐角苷，是從槐角提取的化合物，為白色針尖狀結晶，難溶於水、乙醇，稍溶於熱乙醇，溶於吡啶、稀鹼，不溶於乙酸乙酯、丙酮，其化學結構式如下所示：

目前，關於槐角苷的藥理活性報導主要是抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用，至今未見槐角苷具有肝x受體-β(lxrβ)拮抗活性的相關報導。

技術實現要素：

本發明的目的是提供槐角苷的一種新藥物用途，以拓展槐角苷的應用價值。

本發明所述的槐角苷的藥物用途，是指以槐角苷作為活性成分用於製備肝x受體-β(lxrβ)拮抗劑。

進一步說，本發明所述的槐角苷的藥物用途，是指以槐角苷作為活性成分用於製備預防、緩解和/或治療由lxrβ介導的代謝性疾病的藥物。

更進一步說，所述的代謝性疾病包括但不限於：代謝症候群、糖尿病(更佳地為ⅱ型糖尿病)、胰島素抵抗、高脂血症、肥胖症、動脈粥樣硬化、脂肪肝和/或它們的併發症。

作為優選方案，以槐角苷作為活性成分用於製備治療脂肪肝的藥物。

本領域技術人員應理解，本發明中所述的槐角苷可通過多種本領域熟知的方法、利用公知的原料獲得，比如化學合成或從植物中提取分離等。

本發明所述藥物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達體內的劑型都是可以的，包括但不限於：片劑、膠囊劑、粉末、顆粒劑、糖漿、溶液、懸浮液、注射劑、酊劑、口服液、氣霧劑、口含劑、衝劑、丸劑、散劑等常見劑型或納米製劑等緩釋劑型。

與現有技術相比，本發明具有如下顯著性有益效果：

本發明的實驗結果表明：槐角苷能夠選擇性的抑制lxrβ的轉錄活性，具有明顯的抑制脂肪細胞分化的體外效果，以及阻斷高脂餐誘導的c57bl/6小鼠體重增加、抑制體脂肪細胞的體積增加、改善小鼠空腹血糖、胰島素抵抗和小鼠的血脂異常等體內效果，可通過選擇性的抑制lxrβ的轉錄活性達到預防、緩解和/或治療由lxrβ介導的代謝性疾病，可望開發為一種低毒高效的lxrβ拮抗劑及用於製備預防、緩解和/或治療由lxrβ介導的代謝性疾病的藥物，尤其可望開發為一種製備治療脂肪肝的藥物。

附圖說明

圖1a體現了槐角苷對核受體lxrα轉錄活性的影響；1b體現了槐角苷對核受體lxrβ轉錄活性的影響。

圖2a和圖2b分別體現了lxr激動劑gw3965與lxrα和β的結合作用，圖2c體現了槐角苷與lxrα和β的結合作用。

圖3體現了槐角苷對肥胖小鼠脂肪細胞體積的減小作用。

圖4a和圖4b分別體現了槐角苷對高脂飼料誘導的c57bl/6小鼠葡萄糖耐受能力和胰島素耐受能力的影響。

圖5a至圖5c分別體現了槐角苷對高脂飼料誘導的c57bl/6小鼠血清胰島素、脂聯素和瘦素的作用。

圖6體現了槐角苷對高脂飼料誘導的c57bl/6小鼠血脂異常的治療作用。

圖7a和圖7b分別體現了槐角苷對高脂飼料誘導的c57bl/6小鼠肝臟的甘油三酯和膽固醇含量的影響。

圖8體現了槐角苷對高脂飼料誘導的c57bl/6小鼠肝臟形態學的影響。

圖中：*表示與對照組比較，p98％，來源於市購。

2.實驗試劑與儀器

dmem培養液(hyclone，logan，ut)；

胰蛋白酶(gibco，usa)；

小牛血清(gibco，usa)；

oilredo(sigma，st.louis，mo)；

dexamethasone(sigma，st.louis，mo)；

insulin(sigma，st.louis，mo)；

dmso(sigma，st.louis，mo)；

hdtransfectionreagent(roche，mannheim，germany)；

rosiglitazone(sigma，st.louis，mo)；

gw3965(sigma，st.louis，mo)；

dual-luciferasereporterassaysystem(promega，usa)；

plasmidmidikit(25)(qiagen，germany)；

二氧化碳培養箱(thermoscientific，rs-485，usa)；

潔淨工作檯(airtech，sw-cj，usa)；

細胞顯微鏡(olympus，ckx41，japan)；

電鏡掃描儀(philip，xl-30，usa)；

高速冷凍離心機(eppendorfcentrifuge5810r，germany)；

小型臺式高速冷凍離心機(eppendorfcentrifuge5424r，germany)；

通用臺式冷凍離心機(eppendorfcentrifuge5415r，germany)；

多功能酶標儀(bio-tek，synergyht，usa)；

製冰機(雪科電器有限公司，ims-40，中國)；

凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，tanon-2500，中國)；

移液器(eppendorfresearch，germany)；

恆溫培養箱(上海一恆科技有限公司，dhp-9082，中國)；

48孔板(corning，usa)；

0.22μm、0.45μm微孔濾膜(millipore，germany)；

異丙醇、福馬林、娥酸(分析純，國藥集團上海化學試劑公司)；

3.lxrα/β報告基因分析

(1)293t細胞培養

293t細胞株(人胚腎細胞株)用含10％小牛血清及1％雙抗的dmem高糖培養基於37℃、5％co2培養箱中培養。取對數生長期的293t細胞鋪板，細胞密度為1×105～2×105個/ml鋪板於48孔板中。

(2)供轉染質粒

pcmx-gal-mlxrα，βlbd質粒，gal4reportervectormh100×4-tk-luc重組質粒以及renillaluciferase內參質粒。

(3)轉染

過夜，待細胞長至50～80％的密度時，進行轉染。用dmem(無血清無雙抗)配製轉染體系：在每毫升的dmem中含有10μg的總質粒，以及15μl的轉染試劑-fugenehd(roche,mannheim,germany)，然後將轉染體系渦旋混勻，並室溫放置15min，然後將轉染體系共轉染於293t細胞中，培養4～6h後，換用完全培養基(dmem，10％fbs，1％雙抗)繼續培養至24h。

(4)加藥幹預

24h後，加入用完全培養基稀釋的不同濃度梯度(10、25、50μm)的槐角苷進行幹預，每孔加入250μl終濃度藥物溶液，並且同時加入lxr激動劑gw3965(10μm)。

(5)細胞處理

①24h後，用pbs清洗細胞兩次，除去剩餘的細胞培養液；

②每孔加入65μl的裂解液，搖床振蕩15min，待細胞裂解完全，將細胞裂解液轉移到1.5ml離心管中；

③將細胞裂解液於1000rpm離心5min，取上清液10μl於新的離心管中，待測。

(6)測定與分析螢光素酶強度

①加larⅱ液20μl，混勻，測螢光，2秒延遲，讀10秒；轉染效率利用內參renilla螢光素酶活性校正，所有轉染實驗至少獨立重複三次，每個實驗組至少2個副孔。

②利用bio-tek，synergyht多功能酶標儀進行螢火蟲和海洋腔腸螢光強度檢測，螢火蟲螢光素酶表達強度用螢火蟲螢光和海洋腔腸螢光強度的比值表示，相對螢光強度＝螢火蟲螢光強度/海洋腔腸螢光強度，即主要利用螢光素酶相對表達活性反映外加藥物是否通過與lxrα，β受體發生功能性結合來影響lxrα，β轉錄活性。

4.動物與分組

高脂食物餵養的c57bl/6小鼠可出現肥胖、高脂血症及ii型糖尿病的典型症狀。通過動物口服給藥，觀察動物體重、體內脂肪含量、血脂、血漿葡萄糖水平、血漿胰島素、葡萄糖耐受試驗、胰島素耐受試驗等。

8周齡小鼠用含60％(w/w)脂肪的高脂飼料餵養三個月，小鼠形成肥胖、高脂血症、胰島素抵抗等，將槐角苷按0.01％比例混入飼料，讓小鼠自由進食、飲水，共治療4周，隔日記錄小鼠體重和攝食量。

5.血脂測定

小鼠禁食12小時，心臟採血，靜置2小時，3000rpm離心15min，收集小鼠血清，全自動生化儀測甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平。

6.肝脂測定

小鼠禁食12小時，處死後取肝臟，剪取肝臟組織大約50mg左右，稱重，置於組織裂解液中，用超聲波細胞粉碎儀將肝臟粉碎，等體積的氯仿提取肝脂成分，經過12000rpm離心10分鐘，取氯仿層，將氯仿層自然乾燥後加入50μl異丙醇溶解，測甘油三酯和膽固醇水平，肝臟內的脂質含量以脂質含量(mg)/肝臟重量(g)的結果表示。

7.肝臟切片染色

肝臟組織經10％福馬林的組織固定液固定，切片、使用he染色和油紅染色、拍片。

8.脂肪切片染色

各組小鼠經過麻醉處死後取動物白色脂肪組織用含有10％福馬林的組織固定液固定切片、染色、拍片。

9.血糖測定

治療結束測小鼠葡萄糖耐受試驗：小鼠腹腔注射1g/kg體重葡萄糖，0、15、30、60、90、120min時測小鼠尾靜脈血糖值。

測小鼠胰島素糖耐受試驗：小鼠休息3天，注射胰島素10u/kg體重，分別於0、15、30、60、90min時測小鼠尾靜脈血糖值。

10.統計

兩組數據採用t檢驗，多組數據採用anova統計處理，數據以均數±標準誤表示，p<0.05表示顯著差異。

ii.實施例

實施例1：槐角苷對核受體lxrα，β轉錄活性的影響

使用lxrα，β兩種核受體的gal4-dbd-lbd表達質粒和gal4響應的螢光素酶報告基因系統分析槐角苷對2種核受體轉錄活性的影響。

將gal4-dbd-lbd表達質粒和gal4-螢光素酶報告基因質粒共轉染於293t細胞後經lxr激動劑gw3965(10μm)和槐角苷(5、10、20μg/ml)處理24小時，檢測其螢火蟲螢光素酶活性，以renilla活性作為內參以判斷報告基因活性，數據為三次實驗結果，用means±se表示，*p<0.05。

結果顯示：在lxr激動劑gw3965存在的情況下，槐角苷以一種濃度依賴的方式競爭 性的抑制了lxrβ的活性，藥物在12.5、25、50μm三種不同濃度的用藥情況下均顯示了顯著的抑制效果(見圖1b所示)；然而在相同的用藥處理情況下，槐角苷並未顯現出對lxrα的活性有顯著的調控效果(見圖1a所示)，說明槐角苷可作為活性成分用於製備肝x受體-β(lxrβ受體)拮抗劑。

實施例2：應用時間分辨螢光共振能量轉移(tr-fret)實驗檢測槐角苷與核受體lxr的結合能力

通過應用時間分辨螢光共振能量轉移實驗檢測槐角苷從受體位點置換出標記配體的能力來間接反應槐角苷與核受體lxrα和β的結合能力。

使用invitrogen公司測試lxr轉錄輔因子檢測試劑盒(tr-fret)，先加10μl不同濃度梯度的2x待測化合物、2x陽性對照化合物到384孔板中，然後加入5μl4xlxrα和β-lbd/tb-anti-gst抗體，5μl4x螢光染料，避光，輕輕振搖30s後於1000rpm離心，再在室溫孵育1～2h，用envision測試495nm和520nm的螢光信號。

實驗結果詳見圖2a～圖2c，其中：圖2a和圖2b分別所示lxr激動劑gw3965與lxrα和β的結合作用，圖2c所示為槐角苷與lxrα和β的結合作用；結合圖2a～圖2c可見：槐角苷與lxr激動劑gw3965競爭lxrβ結合位點，但不競爭lxrα結合位點，說明槐角苷具有lxrβ選擇性拮抗活性。

實施例3：槐角苷的減肥作用驗證

由於lxrβ的轉錄活性與脂肪酸合成和甘油三脂的代謝密切相關，抑制lxrβ的轉錄活性能夠起到抑制甘油三脂合成和減肥的效果。所以本專利發明人利用肥胖小鼠(小鼠經正常飼料、高脂飼料及混有0.01％槐角苷的高脂飼料餵食8周，每周測量小鼠體重；數據為mean±se，各組n＝7)來驗證槐角苷是否具有抑制脂肪細胞的效果。

結果顯示：槐角苷餵食2周不能阻斷高脂餐誘導c57bl/6小鼠的體重增加，但採用切片後he染色檢測小鼠白脂肪大小，發現具有抑制肥胖小鼠脂肪細胞肥大的作用(見圖3所示)，說明槐角苷具有一定的減肥作用。

實施例4：槐角苷的降血糖作用驗證

1.槐角苷給藥小鼠的空腹血糖試驗和葡萄糖耐受試驗

因肥胖與胰島素抵抗、高血糖密切相關。由於在實施例2中我們使經正常飼料、高脂飼料及混有0.01％槐角苷的高脂飼料餵食4周後的小鼠禁食12小時，然後以尾尖取血的方式收集並測量各組小鼠的空腹血糖(0min)，然後將葡糖糖(1g葡萄糖/kg體重)以腹腔注射的方式給予各組小鼠，並於之後的15min、30min、60min、90min和120min分別測試各 組小鼠的血糖值，數據為mean±se，各組n＝7。

結果顯示：高脂飼料飼養的小鼠空腹血糖顯著高於低脂對照小鼠，經槐角苷給藥後的小鼠在120min時的血糖值較高脂對照組小鼠有了顯著的降低(見圖4a所示)，說明槐角苷能明顯的改善高脂餐誘導小鼠的空腹血糖和葡萄糖的耐受能力。

2.槐角苷給藥小鼠的胰島素耐受試驗

在明確槐角苷能改善小鼠葡萄糖耐量後，我們使經正常飼料、高脂飼料及混有0.01％槐角苷的高脂飼料餵食4周後的小鼠測試小鼠尾靜脈隨機血糖(0min)，並將胰島素(1u/kg體重)注射於各組小鼠，分別於30、60、90min時測小鼠尾靜脈血糖值，數據為mean±se，各組n＝7。

結果表明：經槐角苷給藥後的小鼠在120min時的血糖值較高脂對照組小鼠有了顯著的降低(見圖4b所示)，說明槐角苷能改善高脂餐誘導小鼠的胰島素抵抗。

3.槐角苷給藥小鼠的胰島素、脂聯素和瘦素試驗

因肥胖可以誘導肥胖小鼠的胰島素和瘦素抵抗，會使肥胖小鼠血清中胰島素和瘦素明顯升高，而脂聯素水平下降；而檢測經槐角苷治療4周後的肥胖小鼠的血清，發現其中的胰島素和瘦素明顯降低，而脂聯素水平顯著升高(見圖5a至圖5c所示)，說明槐角苷能改善肥胖小鼠胰島素抵抗，有利於糖尿病和脂肪肝等疾病的治療。

實施例5：槐角苷對高脂餐誘導的c57bl/6小鼠血脂異常的治療作用驗證

對經高脂飼料餵養三個月的肥胖小鼠給予混有0.01％槐角苷的高脂飼料餵食4周，然後使小鼠禁食12小時，利用心臟採血的方式收集禁食後小鼠的血樣，測定各組小鼠血清中的總膽固醇(tc)、甘油三脂(tg)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)水平，數據為mean±se，各組n＝7。實驗發現：小鼠血清中的甘油三酯水平顯著低於高脂對照組，但對膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白無明顯作用(見圖6所示)，說明槐角苷可治療高甘油三酯血症。

實施例6：槐角苷對肥胖小鼠脂肪肝的改善作用驗證

對經槐角苷治療4周後的肥胖小鼠進行分析發現，小鼠肝臟的甘油三酯和膽固醇含量顯著低於高脂對照組(見圖7a和圖7b所示)；進一步使用小鼠肝臟切片，經油紅染色和he染色，結果也顯示：經槐角苷治療的小鼠肝臟脂肪顯著低於對照組，肝臟形態學明顯優於對照組小鼠(見圖8所示)，說明槐角苷對脂肪肝有顯著的治療作用。

綜上實驗可見：槐角苷能夠選擇性的抑制lxrβ的轉錄活性，具有明顯的抑制脂肪細胞分化的體外效果，以及阻斷高脂餐誘導的c57bl/6小鼠體重增加、抑制體脂肪細胞的體 積增加、改善小鼠空腹血糖、胰島素抵抗和小鼠的血脂異常等體內效果，可通過選擇性的抑制lxrβ的轉錄活性達到預防、緩解和/或治療由lxrβ介導的代謝性疾病的作用，可望開發為一種低毒高效的lxrβ受體拮抗劑及用於製備預防、緩解和/或治療由lxrβ介導的代謝性疾病的藥物，尤其可望開發為一種製備治療脂肪肝的藥物。

最後需要在此說明的是：在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。