輪狀病毒的細胞培養方法
2023-08-04 03:22:36 2
專利名稱：輪狀病毒的細胞培養方法
輪狀病毒的細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及輪狀病毒，特別涉及一種輪狀病毒的細胞培養方法。背景技術：
輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬於呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是各種幼齡動物非細 菌性腹瀉的主要病原之一。RV基因由11個不連續的dsRNA節段組成，其平均長度約為 660 3300bp，分別編碼6個結構蛋白(VPl，VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)和5個非結構蛋白 (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)。RV在電鏡下呈球形，無囊膜，由內向外擁有核衣殼、內衣 殼、外衣殼三層蛋白質衣殼。根據RV群抗原的不同及病毒RNA末端指紋圖譜的分析，可將該 病毒共分為A G七個群；根據其中和抗原VP7的差異可將A組RV分為14個G型(Gl G14)及 21 個 P 型(Pl P24)。輪狀病毒腹瀉是由RV引起的胃腸道感染性腹瀉，是流行廣泛的人獸共患病，也是 多種幼齡動物與嬰幼兒的一種急性腸道傳染病。臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和酸鹼平衡紊亂 為特徵，主要發生於5歲以內的兒童，是秋冬季引起小兒死亡的主要原因之一。幾乎所有兒 童在5歲以前都受到過RV感染。據統計，全球每年約有1. 11億-1. 35億例RV腹瀉病例， 導致65萬名嬰兒死亡。在我國，每年也約有1800萬名嬰幼兒患RV感染性胃腸炎，死亡3-4 萬例。自從1968年在美國阿拉斯加州一農場犢牛腹瀉病例中分離到牛輪狀病毒 (Bovine Rotavirus, BRV)後，隨後許多國家都有BRV感染的報導，我國亦有牛感染輪狀病 毒的報導。RV主要感染1 7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機能紊亂，感染牛、犬和豬往 往發生死亡，病死率可達50%。據報導英國犢牛RV腹瀉的發病率為60 80%，死亡率為 0 50%。該病發生於世界各地，主要造成犢牛腹瀉，給犢牛的生長和生產帶來很大的經濟 損失。目前尚無治療牛RV感染的特效藥物，常規治療效果不佳，因此仍以疫苗預防為 主。而細胞分離培養的成功與否是疫苗研製的關鍵之一。RV分離培養比較困難，應用易感細胞並適當處理是細胞培養RV的關鍵環節。RV 的分離培養在最初多採用原代細胞，後來使用易感細胞系恆河猴腎傳代細胞(MA-104)。20 世紀80年代我國應用MA-104細胞系分離到BRV，開始了 BRV的研究。國外己獲批准的人用 輪狀病毒疫苗多採用非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)或胎猴一倍體細胞(FIihL-幻培養，一些 尚在研發中的疫苗也有採用原代猴腎細胞或雞胚細胞培養製備的疫苗。《中國藥典》規定原 代細胞可使用原始培養的細胞或傳了少數幾代的細胞，《中國生物製品規程》中規定輪狀病 毒疫苗生產用細胞基質為原代或一代新生小牛腎細胞。由此可見，對於RV的細胞培養要求各不相同，而且培養的方法亦有差異，尤其是 人和動物輪狀病毒對細胞的適應性也不相同，BRV和豬輪狀病毒(PorcineRotaVirus，PRV) 對細胞的適應性也不同。
發明內容有鑑於此，為克服現有技術的不足，本發明提供一種同時適用於人和動物的輪狀 病毒的細胞培養方法。一種輪狀病毒的細胞培養方法，包括以下步驟以10%小牛血清加高糖DMEM作 為細胞生長液，將輪狀病毒腹瀉病人或動物糞便標本用0. IM的IXPBS製成10%懸液，經 50yg/mL胰酶在37°C下作用1小時後接種於MA-104羅猴腎細胞，在37°C下吸附Ih;以及 加含5 μ g/mL胰酶的無血清DMEM細胞培養液，37°C下5% C2O2轉鼓培養3 4天，CPE達到 90%時收穫細胞培養液，凍融2次，作為下一代培養的接種物培養傳代。本發明的輪狀病毒的細胞培養方法可適用於人或動物，通過對糞便標本的多次培 養，效果可靠，重複性良好。
具體實施方式為更好地理解本發明，以下將結合具體實例對發明進行詳細的說明。如前文所述，通過對患病幼兒、犢牛、仔豬和仔犬等輪狀病毒陽性糞便樣品的處理 與培養，以期為研發快速準確的診斷試劑盒和有效疫苗奠定基礎，本發明提供一種輪狀病 毒的細胞培養方法。1.糞便樣本的採集與檢測採集動物醫學臨床和養殖場疑似輪狀病毒性腹瀉的犢牛、仔豬和幼犬糞便樣本 68、58和35份，用輪狀病毒酶標診斷試劑盒檢測，檢測出陽性樣本17、5和20例。同時使用 ELISA檢測的幼兒陽性糞樣10份作為樣本。2.細胞株和標準病毒株採用羅猴腎細胞株(MA-104)、豬輪狀病毒參考株(AV-5Q及牛輪狀病毒參考株 (AV52, G6 血清型)。3.主要試劑與設備儀器採用的試劑包括小牛血清(Calf serum)、DMEM細胞培養基 (Dulbecco 『 sModified Eagle Medium, DMEM)、胰蛋白酶(trypsin)、磷酸鹽緩衝液 (Phosphatebuffered saline，PBS)、穀氨醯胺(Glutamine)、0. 01mol/L PBS(pH 7.2)， D-Hanks 液,聚乙二酉享(Polyethylene glycol)。採用的儀器有美國Rayto RT-6000全自動酶標儀、電熱恆溫培養箱、C2O2培養箱 及德國Leica顯微鏡。4.溶液及其培養基的製備4.1胰蛋白酶溶液用IXPBS配製成0.25%溶液，過濾除菌。4. 2DMEM(高糖)培養基將DMEM配製成9. 4g/L的培養基溶液或按照產品說明書。4. 3細胞生長液A液為10 %胎牛血清+高糖DMEM培養液；B液為5 %小牛血清+高糖DMEM培養 液；C液為10%小牛血清+高糖DMEM培養液。在IOOmL細胞培養瓶中加入87mL DMEM培養基溶液及IOmL血清，加入3%的穀氨醯胺、PBS及7. 5% NaHCO3溶液各lmL，再加入青黴素100U/mL、鏈黴素100 μ g/mL。4. 5細胞培養液甲液2μ g/mL 胰酶，DMEM ；乙液3 μ g/mL 胰酶，DMEM ；丙液5 μ g/mL 胰酶 DMEM0 甲、乙、丙液中均加入青黴素100IU/mL、鏈黴素100 μ g/mL。5.實驗方法5.1樣本處理與檢測5. 1. 1製備10%的糞便樣本懸液取糞便樣本0.2g或200 μ L移至EP管中，加入IXPBS (0. 1M)標本處理液，振蕩3 次，每次20s。然後靜置10min，8000r/min離心5min，吸取上清，用0. 22nm的膜過濾除菌， 製備10%成樣本懸液，或分裝後-20°C保存。5. 1.2樣本檢測取適量糞便樣本懸液，移入EP管中，在包被板的每個孔加入糞便樣本懸液50 μ L， 並設陰性、陽性對照各兩孔及空白，每孔50 μ L。每孔再加入50 μ L酶結合物，空白除外。封口後37°C水浴30min，甩去板中液體，拍幹。如此反覆5次。每孔加入50 μ L底物A和50 μ L底物B，37°C水浴lOmin，再加入50 μ L終止液，震 蕩混勻。用酶標儀測定OD45tl值。5. 1.3陽性樣本處理經ELISA檢測呈陽性的樣本，用0. IM的IXPBS製成10%懸液，4°C下3000r/min， 離心20min，取上清，4°C下再10000r/min，離心30min，再取上清，加入青黴素、鏈黴素和慶 大黴素，混合後置4°C冰箱過夜。病毒懸液濾過除菌後，緩慢滴加濃度為400g/L的PEG6000， 至終濃度70g/L，調節至PH7.5，4°C冰箱過夜，即得到陽性處理樣品(+)。另取ELISA檢測呈 陰性的樣品，經上述步驟進行處理，製成陰性處理樣品(_)，作為對照。5. 2MA-104細胞的復甦與培養取出細胞凍存管，於37°C溫水融化，放入IOmL細胞生長液的培養瓶中，並用細胞 生長液衝洗凍存管數次，5% C2O2培養箱培養2 池取出細胞瓶，倒去細胞生長液，移入 13 15mL新細胞生長液，再放入5% C2O2培養箱培養。將MA-104細胞分為三組，分別接種於含有IOmLA液、B液和C液的細胞生長 液中，5% C2&37°C培養箱培養，每3 5d傳代1次；如此重複，直至細胞長到90%以上 進行傳代。傳代時取長滿單層的細胞，用少量PBS溶液清洗細胞表面，加入胰酶消化液 ^iiL/75Cm2)37°C消化，觀察到大部分細胞腫脹、變圓時，輕拍並翻轉細胞瓶，使細胞自瓶壁 脫落，補充適量含10%小牛血清的DMEM細胞生長液，用吸管上下吹打數次以打散細胞團 塊，混合均勻後，按1 :2比例移至新的細胞瓶中，5% C2O2，37 °C繼續培養。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，比較MA-104細胞在三種細胞生長液中的生長 情況，以選擇最佳細胞生長液。表1. MA-104細胞在不同細胞生長液的生長情況
權利要求
1. 一種輪狀病毒的細胞培養方法，包括以下步驟以10%小牛血清加高糖DMEM作為細胞生長液，將輪狀病毒腹瀉病人或動物糞便標本 用0. IM的IXPBS製成10%懸液，經50 μ g/mL胰酶在37°C下作用1小時後接種於MA-104 羅猴腎細胞，在37°C下吸附Ih ；以及加含5 μ g/mL胰酶的無血清DMEM細胞培養液，37°C下5% C2O2轉鼓培養3 4天，CPE 達到90%時收穫細胞培養液，凍融2次，作為下一代培養的接種物培養傳代。
全文摘要
本發明涉及一種輪狀病毒的細胞培養方法，包括以下步驟以10％小牛血清加高糖DMEM作為細胞生長液，將輪狀病毒腹瀉病人或動物糞便標本用0.1M的1×PBS製成10％懸液，經50μg/mL胰酶在37℃下作用1小時後接種於MA-104羅猴腎細胞，在37℃下吸附1h；以及加含5μg/mL胰酶的無血清DMEM細胞培養液，37℃下5％C2O2轉鼓培養3～4天，CPE達到90％時收穫細胞培養液，凍融2次，作為下一代培養的接種物培養傳代。本發明的輪狀病毒的細胞培養方法可適用於人或動物，通過對糞便標本的多次培養，效果可靠，重複性良好。
文檔編號C12N7/00GK102120986SQ20101056396
公開日2011年7月13日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者何麗, 馮若飛, 宋昌軍, 鞏轉娣, 魏鎖成 申請人:魏鎖成