水解核糖核酸(RNAs)的化合物的製作方法
2023-08-03 23:00:16 2
專利名稱：水解核糖核酸(RNAs)的化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及水解核酸的方法和化合物。特別地，本發明涉及用於優先切割RNA中特定位點的磷酸二酯鍵的化合物。因此本發明特別是從反義策略(antisense strategies)的角度為研究與分子生物學有關的蛋白質工程領域和醫學領域提供了一個有用工具。
背景技術：
反義技術(antisense technology)是在發現DNA和/或RNA的轉錄或翻譯能使用連接到靶核酸上的寡核苷酸進行調控的基礎上建立起來的。這樣的反義寡核苷酸被認為是與有意義的DNA或RNA靶核酸互補並且具有反向序列的寡核苷酸。當天然寡核苷酸被應用於反義策略時，即具有標準的、天然鹼基和主鏈的寡核苷酸，其一般應該包含至少17個鹼基才能有效激活RNaseH活性，從而具有向下調節基因表達的效果。
隨著該領域的發展，已提出多種對於寡核苷酸的修飾，以使它們在被使用時更加穩定。特別地，如果將反義寡核苷酸引入到完整細胞中時，它們會暴露在RNA和DNA特異的核酸酶的攻擊之下從而失去活性。已描述過的能抑制由核酸酶引起的降解的修飾體有2』-O-烷基或烯基(烯丙基)或炔基(alkynyl)核苷酸，封閉核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，硫代磷酸酯，嗎啡啉寡核苷酸等。
在另一方向上，人工核糖核酸酶因為其在基因操縱上潛在的應用而受到重視。尤其是將RNA-切割分子連接到寡核苷酸(DNAs)的末端。這種寡核苷酸與靶RNA的特異序列雜交後切割RNA上的特定位點。在這方面，特別是使用了通過分子內酸鹼的協同作用對水解敏感的胞嘧啶和腺嘌吟(CA)間的磷酸二酯鍵。水解發生在胞嘧啶核苷酸的3』-端上。
Komiyama等在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1995，77-78中報導了將二乙烯三胺(DETA)通過氨基甲酸鍵錨定到19聚DNA的5』-末端的雜交體可以選擇性的水解線性RNA胞嘧啶3』-末端，以產生具有3』-磷酸末端的22聚RNA片段。選擇性切斷是因為DNA-DETA加合物中乙二胺[-N(CH2)2NH2]部分中銨陽離子和中性胺中的分子內酸鹼協作造成的。在溫度50℃，pH值為8的條件下，孵育4小時後，只有10mol％的RNA被水解。
為了在這方面取得發展，Verheijen描述了一種具有10聚PNA的DETA加合物(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。因為PNA能抵抗生物降解，同時由於PNAs和RNA(或DNA)鍵結合力比天然寡核苷酸更強，10個PNA單體的寡聚物長度足以用來雜交，因此PNA被選為寡核苷酸。DETA切割部分與PNA通過尿素鍵耦合。在靶RNA中，通過用胞嘧啶取代鳥嘌呤而引入另一個切割位點。實際上，靶RNA會在兩個位點發生水解，並且在pH7，40℃孵育4小時後，RNA水解的總轉化率大概為29％(需要注意的是這些條件相比komiyama試驗中使用的條件能夠更好的代表生理條件)。
下面就是兩篇現有技術文獻的示意性說明。第一個是Komiyama等所用到的RNA(30聚)和DNA-DETA的複合體，接下來的是Verheijen所用到的RNA(25聚)和PNA-DETA的複合體。DETA代表NH(CH2)2NH(CH2)2NH2。核苷酸單元由大寫字母寫出，PNA單元由小寫字母寫出。箭頭標註了RNA通過DNA-DETA或PNA-DETA發生水解的切割位點。注意KomiyamaRNA中的19位的鳥嘌呤被Verheijen RNA中的胞嘧啶所替代。
Komiyama↓[RNA]5』-GGAGGUCCUGUGUUCGAUCCACAGAAUUCG-3』●●●●●●●●●●●●●●●●●●●[DNA-DETA] 3』-TCCAGGACACAAGCTAGGT-O(C＝O)-DETAVerheijen6↓17↓19↓[RNA]5』-UCCUGUGUUCGAUCCACACAAUUCG-3』●●●●●●●●●●[PNA-DETA] 3』-caagctaggt-NH(C＝O)-DETA前面已經提到，Verheijen RNA在兩個位點發生水解，即在C17和C19的3』-端。在孵育7小時後，RNA∶PNA-DETA的比例是1∶33，大約50％的RNA被水解了其中大約15％是水解於C17的3』-端，35％水解於C19的3』-端。此外，Verheijen注意到，因U6的3』-端的斷裂產生了少量的降解產品。此處斷裂是因為10聚PNA寡聚體相當於1個螺旋-轉角，位於與U6和G7間的磷酸二酯鍵相鄰的RNA·PNA-DETA複合體的乙二胺殘基處。
要考慮的該領域的其他現有技術是Komiyama等發表於Nucleic Acids SymposiumSeries No.29，1993，197-198.的「人工水解核酸酶和核糖核酸酶的分子設計(Moleculardesign of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases)」，該文獻表明從靶tRNA中的兩個可水解磷酸二酯鍵來看，距離末端水解核苷酸三個核苷酸的較遠的鍵比距離末端水解核苷酸一個核苷酸的鍵更容易被水解。然而，需要應當注意的是，Komiyama等得到的人工水解核酸酶是分子建模研究的結果。有經驗的讀者應該知道，這些核酸酶是對雜交位點和發生水解的位點已進行了優化後得到的結果。
Verheijen等人的研究(前文所述)和Vlassov等人的研究，參見Antisense andNucleic Acid Drug Development，1997，vol.7，39-42，實際都上是建立在Komiyama得到的核酸酶基礎上的。Verheijen等人和Vlassov等人都得到了和Komiyama同樣地結論，即距離越遠的可水解的磷酸二酯鍵越易被水解。Valssov等指出，可以通過優化將多聚醯胺基切割基團(polyamine-based cleaving group)和寡核苷酸連接起來的連接手臂的結構的長度和硬度，以及優化與寡核苷酸連接的連接手臂的位點來提高水解或者切割效率的機會。不建議進一步改變寡核苷酸和靶RNA雜交的位點。
本發明的目的是通過提供提高水解效率的化合物通過多胺介導的切割而提高現有技術化合物水解核酸的狀況，尤其是提高水解的速率。
發明內容
現已發現負責核酸水解的多聚醯胺部分(polyamine moiety)到達連接多聚醯胺的寡核苷酸的距離和優化核酸水解的位點之間存在一種關係。在下文中，負責水解的多聚醯胺部分也被稱為切割系統(Cutter)。與所述切割系統連接的寡核苷酸在下文中也被縮寫為寡核酸(Oligo)。切割系統和寡核苷酸之間的距離由共價連接二者的結構元素確定，並且在下文中被稱為間隔區(Spacer)。更為方便地，由間隔區確定的距離用從寡核苷酸到切割系統的原子數目來描述。被計算在內的原子是從寡核苷酸到切割系統間構成直鏈的那些原子。該鏈上可能的取代基或者直鏈上的分枝都不能計算到由間隔區定義的原子數目中。
如果相對於將被水解的隆起位點，寡核苷酸複合體距離至少4個核苷酸遠，那麼相比現有技術的化合物的狀況，令人驚訝地是，底物RNA在胞嘧啶-腺嘌呤序列中胞嘧啶的3』-末端的水解加倍了，負責水解的多聚醯胺部分與寡核苷酸之間的距離至少為在直鏈上的兩個原子。
因此本發明涉及一種核糖核酸水解的方法，其中寡核苷酸或其類似物與包括至少兩個氮原子的切割系統耦合，所述核糖核酸水解中涉及所述的兩個氮原子，且間隔區包括連接所述寡核苷酸的末端核苷酸或其類似物和所述切割系統的直鏈上至少2個原子，在距離將被水解的隆起位點至少4個或者最多8個核苷酸處進行雜交。
本發明的另一方面涉及一種水解核糖核酸的化合物，所述化合物具有的結構是寡核苷酸-間隔區-切割系統其中，寡核苷酸是具有至少8個核苷酸的核糖核酸或其類似物，它能夠以這樣一種方式與靶核酸雜交以使末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點至少4個核苷酸處且至多8個核苷酸處的核苷酸雜交，間隔區將切割系統與所述寡核苷酸的所述末端核苷酸共價連接，並且從寡核苷酸到切割系統的直鏈上包括至少2個原子，切割系統是具有至少兩個氮原子的多聚醯胺。
發明詳述在尋找有效並可靠操縱基因表達的方法中，本發明人研究了選擇性水解靶核糖核酸的可能性。在這方面，關注點針對於通過多聚醯胺介導的切割磷酸二酯鍵起作用的人工核酸酶。
儘管Verheijen報導的現有技術系統(見上文)中，孵育7小時後水解了大約50％的靶核酸，這個量還是令人滿意的，但孵育24小時後也只有85％靶核酸被水解。除此之外，我們注意到靶核酸含有兩個用於水解的隆起位點，而且出現了第三個意外的水解位點。因此該現有技術中的人工核酸酶水解的效率距離要求還有差距，尤其對於沒有兩個或三個而只有一個可選的水解位點的靶核酸。基於上述的現有技術中的靶核酸，我們使用下列合成的RNA序列
15 10 15 20 255』-UCCUGUGUUCGAUCCGCAGAAUUCG-3』隆起水解位點由下劃線標出。水解發生在下劃線標出的胞嘧啶的3』-末端。當計算距離將被水解的位點的核苷酸數目時，胞嘧啶或者腺嘌呤中任意一個都可包括在內，寡核苷酸可以根據方向與5』-末端或3』-末端的任一方向分別進行雜交。因此，在上述給出的RNA序列的例子中，寡核苷酸的末端核苷酸或類似物與距離將被水解的位點至少4個核苷酸處雜交，該末端核苷酸與沿5』-末端方向的第一個尿嘧啶(U13)雜交。沿3』-末端方向，距離將被水解位點4個核苷酸處是位點22的尿嘧啶(U22)。
為了水解上面所述的靶核酸的隆起位置，使用乙二胺(ethylene diamine)作為切割系統。為改變間隔區的長度，將甘氨酸殘基插入寡核苷酸和切割系統之間。
寡核苷酸與距離將被水解的位點兩個或三個核苷酸進行雜交，水解速率相似，且與間隔區中有沒有、有一個或者兩個甘氨酸殘基無關。在pH7，溫度為40℃，RNA與寡核苷酸-間隔區-切割系統比率為1∶33孵育7小時，得到10-20％的中度水解。孵育24小時後，水解率在25-30％間變化。
然而，寡核苷酸與將被水解的位點距離四個位置處發生雜交，卻出現了明顯的靶核糖核酸水解量增加的現象。尤其是對於間隔區包含5個原子的化合物來說，當RNA∶寡核苷酸-間隔區-切割系統比例為1∶33，pH值為7，溫度40℃下，孵育7小時後，水解率大於50％，24小時後，水解率超過95％。
此處所使用的術語「寡核苷酸」指核糖核酸或其類似物。這包括使寡核苷酸在生理環境中更為穩定的核糖核酸的衍生物。合適的衍生物的實例是2』-O-烷基，烯烴(烯丙基)或炔基核苷酸，2』-脫氧核糖核酸(DNA)，和/或2』-脫氧-2』-氟代核苷酸.優選的是2』-氧-甲基和2』-氧-烯丙基核苷酸.可供選擇地或可替換的是磷酸二酯鍵的衍生物，如O-烷基化磷酸二酯或優選硫代磷酸酯。包含核苷酸類似物的寡核苷酸是指包括封閉核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，和嗎啡啉核苷酸的寡核苷酸等。
寡核苷酸中合適的鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷、2，6-氨基嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤，以及這些鹼基的進一步的衍生物，如烷基、氨基、疊氮和/或滷素取代的鹼基或脫氮鹼基。本領域的熟練技術人員能夠知道的並且對鹼基的進一步的修飾體也同樣是適合的。
本發明中的寡核苷酸具有至少8個核苷酸或其類似物的長度。一般而言，為了充分雜交，多於25個核苷酸(或其類似物)的長度將沒有必要。至少10個核苷酸(或其類似物)的長度是優選的。
寡核苷酸具有兩個位點可連接間隔區。該間隔區連接在5』-O或者3』-O的任一原子上。如果寡核苷酸在其任一端包括核苷酸的類似物，則該間隔區則連接到與5』-O或3』-O原子相應的核苷酸類似物內的原子上。
本發明中所使用的術語「間隔區」用於定義寡核苷酸和切割系統之間的距離，用原子數目表示。原子數目是計算直鏈內從與寡核苷酸的末端核苷酸或其類似物上5』-O或3』-O原子相連的第一個原子開始，到與切割系統耦合的最後一個原子。間隔區的末端位於切割靶RNA磷酸二酯鍵中所涉及的切割系統的第一個氮原子。間隔區中的原子可以是熟悉本領域技術人員所知的任何合適原子，優選間隔區中的原子選自C，O，S，N和P，可以相同或不同。
間隔區可以是帶支鏈的和/或間隔區中的原子可以被官能團的基團所取代。這些取代基可具有能檢測本發明的化合物的官能團，例如間隔區可被螢光標記取代。這類標記眾所周知。可供選擇地或進一步的，間隔區也可以被能促進細胞膜通透性的基團所取代。這些基團可以是與細胞膜的脂質雙分子層易於發生相互作用的疏水基，和/或可以是與穿過細胞膜有關的受體或酶相互作用的的基團。
應當理解間隔區-切割系統部分例如可以完全包括聚乙胺(polyetheleneamine)。因為與寡核苷酸中末端核苷酸或其類似物連接的前兩個原子被認為與磷酸二酯鍵的水解無關，所以它們不是切割系統的一部分。
本發明中使用的術語「切割系統」指含有至少兩個氮原子的多聚醯胺。切割系統包含至少一個二級氮原子或者三級氮原子，可任選的，切割系統也可以再有至少一個二級或三級氮原子，優選的是切割系統包含至少另一個一級氮原子。多聚醯胺介導的磷酸二酯的切割在本領域是眾所周知的，熟練的技術人員能夠運用合適的切割系統部分。舉例而言，合適的切割系統包括乙二胺、二乙烯三胺(diethylenetriamine)，三(2-氨基乙基)胺，乙胺基的樹枝狀聚合物(ethyleneamine based dendrimers)，季戊四醇胺(pentaerythrityltetraamine)，精胺，亞精胺，二氮-、三氮-、或者四氮環烷(tetraazacycloalkyl)化合物，如對二氮己環，環烯，四氮茂基癸烷(tetraazacyclopentadecane)，四氮環十四碳烷(tetraazacyclotetradecane)，四氮十一碳烷(tetraazaundecane)，三氮環壬烷(triazacyclononane)，三氮環十二烷(triazacyclododecane)等，以及它們的衍生物。
在一個實施例中，本發明化合物中的寡核苷酸包含作為核苷酸類似物的PNA。
在另一個實施例中，本發明化合物中的寡核苷酸是2』-O-烷基，優選甲基或烯丙基，硫代磷酸酯作為核苷酸類似物。
在一個實施例中，本發明化合物是這樣一個化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點的四個核苷酸處發生雜交，直鏈內從寡核苷酸到達切割系統的原子數目為4-6，優選是5。
當寡核苷酸與距離隆起位置超過4個位置處進行雜交時，優選是增加間隔區的長度，其中所述的隆起位置是核糖核酸被水解的地方。在一個實施例中，寡核苷酸與距離被水解的隆起位置超過4個位置每一個位置進行雜交時，間隔區的長度至少增加6個原子。因此對於寡核苷酸-間隔區-切割系統與距離將被水解的隆起位置5個原子處雜交時，間隔區優選含有至少8個原子，對寡核苷酸-間隔區-切割系統與距離將被水解的隆起位置6個原子處雜交時，間隔區優選含有至少14個原子，對寡核苷酸-間隔區-切割系統距離將被水解的隆起位置7個原子處雜交時，間隔區優選含有至少20個原子，對寡核苷酸-間隔區-切割系統距離將被水解的隆起位置8個原子處雜交時，間隔區優選含有至少26個原子，以此類推。
在另一個實施例中，本發明的化合物是這樣一個化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點5個位置處進行雜交時，直鏈內從寡核苷酸到達切割系統的原子數目為10-12，優選是11。
在另一個實施例中，本發明的化合物是這樣一個化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點6個位置處進行雜交時，直鏈內從寡核苷酸到達切割系統的原子數目為16-18，優選是17。
在另一個實施例中，本發明的化合物是這樣一個化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物在距離被水解的位點7個位置的地方進行雜交時，直鏈內從寡核苷酸到達切割系統的原子數目為22-24，優選是23。
在另一個實施例中，本發明的化合物是這樣一個化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物在距離被水解的位點6個位置的地方進行雜交時，直鏈內從寡核苷酸到達切割系統的原子數目為28-30，優選是29。
末端核苷酸或其類似物的雜交位點距離將被水解的隆起位置的上限是8，優選7，更優選6。間隔區最大長度是30個原子。
本發明中的化合物可以通過本領域內已知的工藝合成。優選的是，該化合物通過自動化的程序合成。舉例而言，指定長度和組成成分的寡核苷酸可以在DNA/RNA合成器中程序化的生產出來。對於熟練操作員而言，製備間隔區-切割系統部分也是日常工作，該部分包括將所需長度的間隔區耦合到所需的切割系統上。具體實例可參看Verheijen等(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。這樣的間隔區-切割系統部分具有與末端核苷酸或核苷上的3』-O或5』-O(優選)耦合的合適的官能團。可供選擇地，對於熟練的技術人員來說，用5』-N代替5』-O並與具有合適官能團的間隔區-切割系統通過氮耦合是一件日常工作，例如參看上文所述Komiyama描述的方法。合適的方法請參看文獻J.Org.Chem.2000，65，4900-4907，Angew.Chem.hit.Ed.，2001，40，2004-2021和更詳細的介紹參看J.Org.Chem.，2003，68，609-612，Bioconjug.Chem.，2003，14，276-28。可供選擇地，可以使用二硫橋跨接(scan)，這需要引入5』-S或通過傳統的馬來醯亞胺耦合。可供選擇地，使用標準的亞磷醯胺(phosphoramidite)化學方法使間隔區-切割系統部分與核苷耦合。這使得任意類型的核糖核酸(相似物)或其類似物可結合到本發明中的化合物中，實例參考Bioconjugate Chem.2002，13(5)，1071。
製備包含PNA作為核苷酸結構單元的本發明的化合物的一種合適的方法由Verheijen提出並已在上文中討論。
本發明提供了能在各種治療，診斷，農業，靶識別，基因發現，基因工程以及基因藥物方面進行應用的有用的化合物和方法。
一方面，本發明涉及一種使核糖核酸在預定的位置進行水解的方法，在該位置處，靶核糖核酸和本發明的化合物相接觸。
可以將本發明的化合物設計成通過靶向各種RNA分子以抑制基因表達。在一個實施例中，使用本發明的化合物靶向與靶基因對應的多種RNAs。這種RNAs的不受限的例子包括信使RNA(mRNA)、靶基因的各種選擇性RNA剪接變體(alternate RNA splice variants)、靶基因轉錄後的修飾的RNA、靶基因的mRNA前體。若選擇性的剪接產生一組使用合適的外顯子可被識別的轉錄片段，本發明可用於通過適當的外顯子特異性的抑制而抑制基因的表達或區別基因家庭成員間的功能。
本發明的化合物可被用作診斷劑，治療劑並作為研究試劑和試劑盒。通過將有效量的本發明化合物加入到合適的藥物上可接受的稀釋劑或載體而將它們應用到藥物組合物中。進一步地，可以將它們應用於治療以產生非需要蛋白質為特徵的疾病的生物機體中。該機體可以和本發明化合物接觸，其中本發明的化合物含有的序列能夠與編碼非需蛋白質的靶核酸鏈特異地雜交。因此，為了調控基因表達，優選預先選擇將被調控的RNA部分包括編碼其形成需要被調控的蛋白質的RNA部分。因此，將所使用的寡核苷酸設計成能與預先選擇的靶RNA部分進行特異的雜交。在一個實施例中，將寡核苷酸設計成與mRNA特異連接的化合物，其中所述的mRNA所編碼的蛋白質的產生需要調控。
治療組合物的配方和它們隨後的給藥屬於本領域的範疇。一般而言，對治療學而言，需要這種治療的病人服用本發明的化合物，通常是通過藥物上可接受的載體，根據病人的年齡、治療狀況的病情嚴重性，從0.01微克到100克每千克體重來確定具體劑量。進一步地，治療可以是單一劑量，也可以是需要一段時間的治療方案，這都需要基於具體的病症，病情嚴重程度以及病人總體的情況來判斷，最終由專業醫生來確定。有些情況下將本發明中的化合物和其他傳統治療方法的結合起來能達到更好的治療效果。
本發明的藥物組合物可以通過多種方法給藥，這取決於是局部或者系統治療的需要，及治療的範圍決定。給藥可以是局部性的(包括眼，陰道，直腸，鼻內，皮膚)，口服或腸胃外給藥，腸胃外給藥包括靜脈點滴，皮下注射，腹膜注射，肌內注射，或膜內給藥或心室內給藥。
局部給藥配方主要包括皮膚外敷片，油膏，乳液，霜類，凝膠，滴露，栓劑，噴霧劑，液體及粉末。傳統藥物載體，水，粉，油基，稠化劑等是必需和讓人滿意的，保險套、手套等也是可用的。
口服給藥組合物主要包括粉和顆粒，水或其他非水介質的懸液或者溶液，膠囊，袋或藥片。可使用稠化劑，調味劑，稀釋劑，乳化劑，分散劑或粘接劑。
膜內或心室內給藥的組合物可以包括無菌水溶液，其中可以含有緩衝劑，稀釋劑和其他合適的添加劑。
腸胃外給藥配方可以包括無菌水溶液，其中可以含有緩衝劑，稀釋劑和其他合適的添加劑。
本發明可以應用於多種生物機體，其範圍包括單細胞原核和真核有機體到多細胞真核有機體。任何利用DNA-RNA轉錄或RNA-蛋白翻譯作為其遺傳，新陳代謝或細胞機制的基本部分的有機體都可以使用這樣的治療和/或預防方法。看起來形式多樣的有機體，如細菌，酵母，原生動物，藻類，植物和高等動物，包括恆溫動物，都可以通過該方法來進行治療。進一步的，因為多細胞真核生物中的每個細胞都包含DNA-RNA轉錄和RNA蛋白質的翻作為其細胞活動的主要部分，上述治療和/或診斷方法也能應用於這樣的細胞群體上。更進一步的，很多細胞器，如真核細胞中的線粒體和葉綠體，也包含轉錄和翻譯機制。同樣地，單細胞，細胞群體，細胞器都可以被涵蓋在能夠接受本發明中化合物治療、診斷的有機體定義中。如這裡所用的治療包括對病的根除，殺死某有機體，如細菌，原生動物或其他傳染病，或對一些異常或不需要的細胞生長或表達進行調控。
實施例實施例1作為在自動化標準DNA/RNA合成器中所使用的合適的結構單元，使用下面所表示的亞磷醯胺。在左下的結構圖中，連接手臂為上文所述間隔區的一部分，因此可從下面所示的通式結構圖中省略掉。PG代表保護基團，優選不穩定的基團。連接手臂可以是甘氨酸部分，並且PG也可以是如下結構中所示的Fmoc。所述的亞磷醯胺可以結合到任何類型的RNA(寡核苷酸)或其類似物中。
在將上述的間隔區具有10個原子的亞磷醯胺與寡核苷酸結合後，得到了下面左圖所表示的結構。這個例子中，間隔區有10個原子。為了說明寡核苷酸類似物2』-O-甲基硫代磷酸酯RNA和PNA分別表示在中間和右邊。
作為替代，使用了能夠結合到5』-末端的間隔區-切割系統部分，如下所示。在該間隔區-切割系統部分中間隔區的長度是變化的。在下面詳細描述的實施例中間隔區分別含4個和10個原子。可以很清楚的看出，間隔區的長度是很容易改變的。
實施例2合成的RNA(tRNAPhe部分具有一個點突變G-16取代了C-16)用於切割實驗(下劃線切割位置)5』-UCC UGU GUU CGA UCC GCAGAA UUC G-3』合成了下面的PNA-切割系統序列，其中Glv代表甘氨酸，n＝0-2.切割系統是 3』-H2NCO-ca caa gct agg(Gly)n-COCH2-切割系統(2)3』-H2NCO-aca caa gct ag(Gly)n-COCH2-切割系統(3)3』-H2NCO-g aca caa gct a(Gly)n-COCH2-切割系統 (4)3』-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)n-COCH2-切割系統(5)3』-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)3-COCH2-切割系統(5)數字(2)、(3)、(4)和(5)指寡核苷酸距離將被水解的隆起位點進行雜交的位置數目。每個(2)、(3)、(4)和(5)結合0，1或2個甘氨酸殘基，間隔區長度變化。
PNA合成本研究中使用的PNAs由PNA合成器(Perseptive生物系統，加速核酸合成系統)通過固相合成法生產。所有溶劑(Biosolve)都使用原溶液。固相合成是在作為固支撐的PEG-PS珠上使用rink-amide作為連結劑進行的(上樣量0.17微mol/毫克)。按照合成手冊上描述的標準方案實現PNAs的合成，使用Fmoc化學和環外胺受Bhoc保護(Perseptive生物系統)的單體，以0.2umol為起始合成量。首先耦合是雙倍的。將Fomc-苷氨酸和diBoc保護的切割系統結構單元耦合到仍在樹脂上的PNA寡聚體的N-末端(5』)上，在遵循標準協議的情況下，通過合成器上的可用位置實現雙耦合。diBoc保護的切割系統結構單元(HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc)是通過直接液相有機化學方法合成得到的，質譜及1H-和13C核磁共振光譜為其全部特徵。
寡聚體從樹脂上切割下來，在酸性環境(TFA/TIS/H2O，9/1/1，v/v/v)中被完全去保護。並在裝備Altima C18柱(10×250mm)的JASCO HPLC系統中進行反相高效液體色譜提純和分析。在40攝氏度條件下進行梯度洗脫，以緩衝液A(0.1％TFA的水溶液)，並採用緩衝液B(0.1％TFA乙腈/水，3/1，v/v)流速為4毫升/分鐘的梯度開始。得到的PNAs被冷凍乾燥，並利用矩陣雷射解吸附/電離飛行時間質量光譜測定(MALDI-TOF MS)和反相高效液體色譜分析確定特徵。
切割實驗在含有NaCl(100mM)及EDTA(0.1mM)的TRIS緩衝液(10mM，pH 7)中用PNA-切割系統處理32P 5』-標記的25聚RNA得到以下濃度[RNA]＝60nM，[PNA-切割系統]＝2μM。於40℃下將樣本(70μL)孵育7或24小時。在此之後，添加NaOAc(3M，pH 5，7μL)、EtOH(225μL)和10μg/μL tRNA(1μL)，RNA立即發生沉澱。沉澱後的RNA通過離心過濾，乾燥和在水(5μL)和上樣緩衝液(5μL)中再溶解進行復性。溶液在90攝氏度被加熱1分鐘，離心，在含有8M尿素的20％變性的聚丙烯醯胺電泳凝膠上進行分析。使用的對照有RNA，RNA鹼基梯和T1消化的RNA。
結果對照RNA在孵育7小時後和24小時後水解了大約10％。對化合物序列號(2)和(3)，RNA在孵育7小時後水解了20％左右或更少，孵育24小時後為40％或更少。
只有從化合物序列號(4)得到了合理的RNA速率水解，即，對N＝0，1，2，RNA在孵育7小時後至少水解30％。對化合物(4)n＝1，在孵育24小時後獲得了幾乎可以量化的水解速率。
對化合物(4)，n＝1的優化顯示孵育2小時後，在RNA/本發明的化合物比例為1∶10大約50％RNA被水解。當比例為1∶40，孵育2小時後有75％發生水解。比例為1∶10和1∶20時，分別孵育8小時和6小時後，75％或更多RNA發生水解。對於後者比例，孵育24小時後水解速率幾乎可進行量化。
(5)號化合物最佳水解開始於n＝2。
實施例3合成RNA(E.Coli AcpP mRNA部分)用於切割實驗(下劃線切割位置)5』-A UUU AAG AGU A UG AGC ACU AUC GAA-3』合成下列PNA-切割系統序列，其中Gly代表甘氨酸，切割系統是 3』-H2NCO-aaa ttc tca t-Cys(NHR)S-CH2CO-Gly-NHCH2CH2-切割系統其中R＝Ac或 (A)CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2或(B)CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2(C)注意化合物B和C的間隔區中包含能幫助化合物穿過細胞膜的肽Lys(PhePheLys)3。
體外RNA降解的研究所有緩衝液均由高純度MilliQ水經消毒在使用前製成。將放射活性標記的25聚RNA和待測的耦合體(A，B，C作為對照RNA並且C中沒有切割系統)混和於三羥甲基氨基甲烷和鹽酸(Tris-HCl)的緩衝液(10mM，pH 7)中，其中含有氯化鈉(100mM)及乙二胺四乙酸(0.1mM)，得到以下濃度[RNA]＝60nM，[耦合體]＝2uM，這由A260值標定。樣品(70uL)在40攝氏度孵育16個小時。孵育之後，添加3M NaOAc(pH 5，7uL)，EtOH(225uL)和10ug/uL的tRNA(1uL)，RNA立即沉澱。通過離心，乾燥，然後重新溶解於5uL水和5uL上樣緩衝液使沉澱後的RNA的復性。溶液在80攝氏度被加熱1分鐘，離心，並在20％變性電泳凝膠上進行分析。將凝膠暴露於磷屏(分子動力學)下，同時RNA碎片的密集度由Personal Molecular Imager FX分子成像系統(Bio-Rad)通過掃描所暴露的屏進行量化，然後通過Quangtity One軟體(Bio-Rad)進行電腦分析。
結果化合物A、B和C和陰性對照與25聚32P標記的RNA一起孵育，所述RNA的序列和E.ColiAcpP mRNA的部分序列一樣。在40攝氏度，pH 7的條件下，孵育16小時後，RNA片段被沉澱，而後施加到20％變性電泳凝膠上並被定量。
令人滿意的是，將RNA和耦合體B、C以及不含肽的PNA-DETA A的共同孵育，產生了兩種主要的RNA降解產品，由在標記的CA和UA點的切割而產生。切割位點通過將T1消化的RNA帶與和基本的水解階梯的帶移動來確定。片段點的密集度揭示了與陰性對照(如，PNA-肽耦合體沒有切割系統和RNA沒有任何附加的耦合)相比，RNA和PNA-DETA A孵育產生了顯著的RNA切割(20％)，本底(background)切割只有約3.5％。發現耦合體B、C水解效率之間的顯著差異。相比於陽性對照18(20％)，耦合體B表現出切割效率(30％)得到提高，而耦合體C切割了10％的靶RNA。
實施例4在3』-末端包含間隔區-切割系統的寡核苷酸使用商業上可購的包含Dde連結劑的樹脂被進行PNA合成。
從這個樹脂開始，後續的PNA合成產生下面的寡核苷酸
3』-切割系統-CH2CH2NH-(Gly)n-CO-PNA序列-NHAc-5』切割系統的定義如下 「CO」是PNA-寡核苷酸的3』-末端和NHAc是5』-末端。
對間隔區-切割系統，基於DNA/RNA的3』-末端的寡核苷酸應用了在實施例1中描述的策略。
權利要求
1.用於核酸水解的化合物，所述化合物具有以下結構寡核苷酸—間隔區—切割系統其中，所述寡核苷酸是具有至少8個核苷酸的核糖核酸或其類似物，它能以這樣一種方式與靶核酸雜交，其末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點至少4個核苷酸和最多8個核苷酸處的核苷酸雜交，所述間隔區將所述的切割系統共價連接到所述寡核苷酸的所述末端核苷酸上，並且包括從寡核苷酸到切割系統的直鏈上的至少2個原子，所述的切割系統是含有至少2個氮原子的多聚醯胺。
2.如權利要求1所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括肽核酸作為核苷酸類似物。
3.如權利要求1所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括2』-O-烷基，優選甲基，硫代磷酸酯作為核苷酸類似物。
4.如前述任一權利要求所述的化合物，其中所述間隔區包括一個或者多個胺基酸，特別是甘氨酸。
5.如前述任一權利要求所述的化合物，其中所述間隔區通過醯胺鍵與所述寡核苷酸耦合。
6.如前述任一權利要求所述的化合物，其中所述切割系統是乙二胺。
7.如前述任一權利要求所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物距離將被水解的位點4個位點，並且從寡核苷酸到切割系統的直鏈上原子數目為4-6，優選5。
8.如前述任一權利要求所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物距離將被水解的位點5個位點，並且從寡核苷酸到切割系統的直鏈上原子數目為10-12，優選11。
9.在預定位點水解核糖核酸的方法，其中靶核糖核酸與前述任一權利要求所述的化合物接觸。
10.如權利要求10所述的方法，其中所述核糖核酸是RNA，特別是信使核糖核酸。
11.一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括權利要求1-8中任一權利要求所述的化合物和藥學上可接受的載體和稀釋劑。
12.權利要求1-8中任一權利要求中所述的化合物作為藥劑的用途。
13.權利要求1-8中任一權利要求所述的化合物做為診斷工具的用途。
全文摘要
本發明涉及一種用於水解核酸的方法和化合物。特別地，本發明涉及用於優先切割RNA中特定位點的磷酸二酯鍵的化合物。
文檔編號C12N9/22GK1946845SQ200580007832
公開日2007年4月11日 申請日期2005年3月9日 優先權日2004年3月9日
發明者伯瑞吉特·汪納爾, 傑勒德·約翰尼斯·普藍特伯格 申請人:蒲羅森薩有限公司