3‑去氧蘇木查爾酮在製備預防和治療結直腸癌藥物中的應用的製作方法
2023-07-24 15:05:06
本發明屬於醫藥化工領域，具體涉及一種化合物3-去氧蘇木查爾酮的抗腫瘤活性，其可用於製備預防和治療結直腸癌藥物、以及靶向結直腸癌中具有促進腫瘤細胞增殖的topk蛋白的藥物開發等。
背景技術：
結直腸癌是消化道惡性腫瘤之一，也是胃腸道腫瘤中僅次於食管癌的第二大惡性腫瘤，結直腸癌在以手術為主聯合化療、放療的綜合治療策略下，療效有一定的進步。但是由於化療失敗導致的結直腸癌的復發和轉移的惡性進展依然是臨床亟待解決的關鍵問題。
topk是一個新近發現的絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶，是一個重要的信號分子。在生理情況下，topk僅表達於睪丸和胸腺中，與機體生殖細胞的成熟和免疫細胞激活有關。近年來研究顯示：topk在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達，不僅調控著腫瘤細胞的有絲分裂和細胞周期，並且參與了腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程。關於topk與腫瘤關係的研究正日益被人們關注，其特異性阻斷劑也已被應用於腫瘤學研究中。而本發明意在通過3-dsc能夠明顯靶向topk，繼而通過其結構類似物得到更多的靶向topk的抑制劑，為臨床治療結腸癌的藥物提供更多的選擇。
技術實現要素：
本發明目的在於提供一種化合物3-去氧蘇木查爾酮的抗腫瘤活性，其在製備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的應用。
我國不僅擁有著豐富的中草藥資源，而且中醫藥在近年來已經以其副作用小，療效獨特的優勢開始踏入世界醫藥舞臺，在我國的腫瘤防治方面更是發揮著重要的作用。而3-去氧蘇木查爾酮，即是從我國傳統中藥材蘇木（caesalpiniasappanl.）中分離得到的天然化合物。前期研究表明：3-去氧蘇木查爾酮（簡稱3-dsc，結構式如下所示，分子式：c16h14o4，分子量：270.3，cas號為112408-67-0）具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗補體作用等；
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本發明中，著重研究了3-去氧蘇木查爾酮在製備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的應用。3-去氧蘇木查爾酮為天然化合物，在驗證其是否具有抑制腫瘤增殖的實驗中要求其純度需≥95％以上。
具體的，可以是3-去氧蘇木查爾酮在製備預防和治療結直腸癌藥物中的應用。
本發明中，通過試驗發現：結合在正常結直腸細胞系中的毒性篩選，確定3-去氧蘇木查爾酮的安全濃度為2.5µm－20µm，並發現在該濃度範圍下，該化合物可以明顯抑制結腸癌不同細胞系的增殖、以及能夠明顯抑制結腸癌細胞克隆的形成數量及大小。此外，3-去氧蘇木查爾酮可以明顯誘導細胞凋亡並阻斷g2/m期致使細胞周期停滯。
3-去氧蘇木查爾酮可用於靶向結直腸癌中具有促進腫瘤細胞增殖的topk蛋白藥物的開發。
本發明中明確topk在結腸癌細胞系中有高表達，並篩選出可以高表達的四個細胞系（hct-15、hct-116、sw620及dld1）。還發現了3-dsc是靶向結直腸癌中的具有促進腫瘤細胞增殖的topk蛋白的天然化合物。在3-dsc結構上進行改造並在適宜條件下合成的衍生物也具有抗腫瘤的作用。
本發明中的靶點為topk蛋白，topk是近年來才作為治療結腸癌患者發現的一個新的蛋白，對於該蛋白的功能研究已經有學者報導過，但是對於將該蛋白作為靶點治療結腸癌患者的藥物還沒有報導過，即使有文獻報導的hi-topk-032可以有效抑制結腸癌中該蛋白的表達，並且作為許多學者進行研究的陽性對照，該抑制劑也沒有應用於臨床治療。因此，本發明欲通過相關實驗證明該天然化合物3-去氧蘇木查爾酮可以有效抑制結腸癌腫瘤的生長並誘導腫瘤細胞的凋亡，從而最終實現該化合物可以用於結直腸癌患者的臨床治療。
本發明通過激酶實驗篩選得到的3-去氧蘇木查爾酮及其ic50值，並證明具有明顯抑制結腸癌細胞增殖的作用。根據在正常結腸細胞中的毒性實驗表明：該化合物3-dsc在20µm時沒有毒性作用，在結腸癌細胞系中的抑制作用可以明確在該濃度條件下，可以有效抑制結腸癌細胞的增殖。此外，本發明發現3-去氧蘇木查爾酮在g2/m期阻斷細胞周期的進行；並可以顯著誘導細胞凋亡。
附圖說明
圖1為通過激酶方法得到靶向topk的化合物，即本發明中的化合物3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）；
圖2為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）在正常結腸細胞中的毒性作用；
圖3為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）在不同結腸癌細胞系中的抑制作用；
圖4為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）抑制結腸癌細胞克隆的形成。其中，隨著化合物濃度的增加，克隆數顯著降低，並且克隆明顯變小。圖為對加藥以及對照組克隆數量的統計結果；
圖5為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）誘導結腸癌細胞周期阻滯，在安全範圍內誘導結腸癌細胞在g2/m期阻滯。結果採用流式測定法對不同濃度3-dsc誘導的g2/m期細胞的阻滯從而表現出g2/m期細胞增多；
圖6為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）具有明顯誘導的細胞凋亡的作用；
圖7為3-dsc可以有效與topk結合併抑制其磷酸化的水平；
圖8為3-dsc可與atp競爭性結合topk激酶位點。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明的技術方案作進一步地詳細介紹，但本發明的保護範圍並不局限於此。
本發明首先通過激酶篩選實驗得到3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）能夠有效靶向topk。在此基礎上進行細胞增殖實驗（mtt，非錨定性生長實驗，細胞周期與凋亡）的研究；藥物靶向蛋白結合實驗研究；藥物與atp的競爭性結合實驗研究；激酶實驗研究；以及藥物靶向topk的信號通路和凋亡的研究包括該天然化合物在不同時間點對信號通路的研究等，最後應用於動物實驗研究。
材料與方法
1材料。
1.1結腸癌細胞系
本發明中使用的結腸癌細胞系均來自於atcc（包括人正常結腸上皮細胞ccd841con、人結腸癌細胞hct-15、hct-116、sw620、sw480、dld1和ht-29）。
1.2試劑
prim-1640培養基（bi公司），mccoy’s5a培養基（bi公司），fbs胎牛血清（bi公司），雙抗（solarbio），胰酶（solarbio），噻唑藍（mtt,sigma公司），二甲基亞碸（dmso，上海市科密歐化學試劑有限公司）；pbs。
1.3耗材及儀器
1.3.1海爾醫用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司），分析天平（梅特勒-託利多儀器上海有限公司），thermo超淨工作檯，水套式co2細胞培養箱（thermo），酶標儀，流式細胞分析儀（bd公司）
1.3.2移液槍，移液管（規格分別為5ml/10、ml/25ml），6孔板，96孔板。
1.4實驗方法。
1.4.1細胞增殖實驗研究：
將已篩選的能夠大量表達topk的結腸癌細胞種於96孔板中，每孔細胞數為1000個，置於37℃，5%co2培養箱中培養，經過24小時，細胞貼壁後，給予3-去氧蘇木查爾酮進行處理，然後分別於0h、24h、48h以及72h後加入20µl噻唑藍（mtt）隨即放入37℃，5%co2培養箱中孵育1個小時，取出後將96孔板內的液體棄掉，加入100µl二甲基亞碸（dmso），利用酶標儀在波長為570nm和620nm下檢測細胞增殖情況。
1.4.2非錨定性實驗研究：
非錨定生長是腫瘤細胞生長的重要特性之一；發明人在不同濃度下察看化合物對結直腸癌細胞生長的抑制作用（下層膠為0.6%agar加入相應濃度的3-dsc，上層膠為0.3%agar加入相應濃度的3-dsc），並在兩周或者三周進行拍照，然後計算抑制效率。
1.4.3細胞周期與凋亡：
將篩選到的敏感結直腸癌細胞以2×105個接種到直徑為60mm的細胞培養皿中，然後放入到37℃，5%co2細胞培養箱中培養24h。細胞周期實驗組待細胞貼壁24h後，加入不含血清（胎牛血清）和雙抗（青鏈黴素混合液）的rpmi1640培養基，飢餓24小時，然後換成含有血清和雙抗的rpmi1640培養基，加藥後繼續培養48h。然後經過收集，70%乙醇固定染色後，用流式細胞儀檢測並分析細胞周期阻滯情況；細胞凋亡實驗組，待細胞貼壁24h後，換不含血清和抗生素的培養基飢餓24小時，然後給予不同濃度（0μm、5μm、10μm、20μm）的化合物治療，72h後收集細胞，檢測並分析細胞凋亡結果。
1.4.43-dsc與topk激酶的結合及抑制實驗：
取激酶反應液60µl及topk激酶8µl混合後，分裝於0.5ml的ep管中，每管17µl混合液，然後於每管中加不同濃度的的化合物3-去氧蘇木查爾酮（0μm、5μm、10μm、20μm）1µl，同時設對照組（即只含有激酶反應液的對照組），於室溫條件下反應10min；再將含有atp和激酶底物的混合液（25µl的atp與10µl的激酶底物）加入到先前的反應液中混合，每管7µl，於30℃的金屬浴中反應30min；然後取出後每管加入5µl的緩衝液（溴酚藍），於95℃的金屬浴中反應5min；取出後，在固定電壓為90v的條件下進行蛋白泳動，再於電壓為70v的條件下將蛋白轉到硝酸纖維素膜上。利用蛋白質免疫印跡技術通過對絲-蘇氨酸磷酸化抗體檢測底物磷酸化水平進而檢測底物蛋白與激酶的含量水平。
1.4.5收集結直腸癌敏感細胞，並通過裂解，bca檢測獲得已知濃度的細胞裂解液。利用瓊脂糖4b結合實驗在蛋白質印跡技術下檢測該化合物與激酶的結合效果，孵育相應的抗體檢測；同時，利用化合物與4b瓊脂糖微球偶聯共聚體，再於不同濃度的atp（0μm、10μm、100μm、1000μm）進行結合，然後在固定電壓為90v的條件下進行蛋白泳動，再於電壓為70v的條件下將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，利用蛋白免疫印跡技術檢測化合物與atp競爭性結合效果。
1.5實驗結果。
本發明首先通過激酶方法篩選得到的化合物3-去氧蘇木查爾酮3-dsc及其ic50值（見圖1），從而判斷該化合物可以有效靶向topk（ic50值小，說明效果較好）。
topk在許多種腫瘤細胞中均有表達，本發明選取了結腸癌細胞系，因此首先對正常結腸細胞系ccd8841con進行毒性篩選，結果見圖2。圖2表明該化合物在20µm時沒有毒性。
本發明同時考察了在不同結腸癌細胞系中3-dsc對結腸癌細胞的抑制作用（給藥處理24、48和72小時，測定細胞生長情況，三次獨立試驗）結果見圖3。
在非錨定性實驗研究中，考察了3-dsc對癌細胞形成的克隆及大小的抑制作用，結果（見圖4）發現，在濃度為20µm時，3-dsc可有明顯抑制克隆的形成或減小克隆形成的面積。
本發明考察了3-dsc對細胞周期的影響，結果（見圖5）顯示3-dsc誘導細胞周期停滯在g2/m期。
本發明考察了3-dsc對細胞凋亡的影響，結果（見圖6）顯示3-dsc可以明顯誘導結腸癌細胞的凋亡。
本發明考察了3-dsc與topk結合及對激酶的抑制作用。結果（見圖7）再次顯示該化合物靶向topk，使其底物發生磷酸化。
本發明也考察了3-dsc與atp競爭性結合topk激酶位點的關係。結果（見圖8）顯示3-dsc在結合topk位點時與atp成競爭關係，再次說明3-dsc可以抑制該激酶的磷酸化活性。
綜上，通過細胞增殖實驗，驗證了3-dsc在結直腸癌細胞系中的抑制效果，尤其在topk高表達的hct-15、hct-116、sw620和dld1四個細胞系中。本發明首先通過激酶篩選實驗得到靶向topk的3-dsc化合物及其ic50值，然後在結腸的正常細胞中進行毒性的篩選，從而確定給藥的安全濃度；再在結直腸癌細胞系中給予化合物3-dsc處理，並在處理後的0h、24h、48h以及72h檢測細胞的增殖情況，在確定該化合物3-dsc對結直腸癌細胞系有抑制作用情況下，並且發現在相同濃度下驗證細胞的非錨定性生長狀況也受到抑制，同時發現細胞周期在g2/m期受到阻滯、並可以明顯誘導細胞凋亡。從而顯示了該化合物對結腸癌細胞有顯著抑制作用。為臨床研究預防和治療結直腸癌藥物提供幫助。