一種afp重組蛋白和體外高效重組表達的方法

2023-07-25 08:31:46

一種afp重組蛋白和體外高效重組表達的方法
【專利摘要】本發明涉及AFP重組蛋白和體外高效重組表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外高效重組表達方法，其DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示，a.優化AFP重組蛋白DNA序列,b.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，並進行質粒抽提，c.將抽提得到的pcDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達，d.7天後分離純化得到的重組蛋白。本發明通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統製備的人工合成帶有6HIS標籤的AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的汙染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。
【專利說明】—種AFP重組蛋白和體外高效重組表達的方法
[【技術領域】]
[0001]本發明涉及AFP重組蛋白和體外重組高效表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外重組表達方法。
[【背景技術】]
[0002]原發性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC,簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一，全球年發病病例大約為120萬人。目前，肝癌治療的總體療效仍很不理想，臨床上肝癌的治療方法主要有外科切除、肝移植等。外科切除的病人的復發率很高，術後3年復發率為50%，5年復發率為70%。肝移植治療，尤其是活體肝移植雖然取得了一定的進展，但卻面臨著供體來源缺乏等問題。因此，臨床上迫切需要研究和發展新的治療肝癌的方法。近年來，隨著免疫學和分子生物學基礎理論研究的迅猛發展，以及人們對肝癌細胞生物學特性認識的加深，肝癌免疫治療成為新的腫瘤治療方法。目前已知的可能成為肝癌免疫治療的靶抗原有:AFP、MAGE家族、HBV/HCV病毒抗原，以及一些癌基因(myc、fos、ras)等。
[0003]AFP是人體胎兒期血液中出現的一種特殊蛋白質。它在胎兒的肝細胞內合成。AFP在成人血清中含量極微，但在肝細胞功能發生異常，特別在患有原發性肝細胞癌時，血清中又可出現AFP升高，所以臨床上常常藉助AFP的檢查作為原發性肝細胞癌的輔助診斷。50%~80%的肝癌患者表達AFP，並且在血清中的濃度可能超過lmg/ml。在人體發育過程中，T細胞庫內針對AFP的特異性CTL克隆並未清除，適當條件和方法可以將之激活，Butterfield等將4條AFP表位肽包裹在不完全福氏佐劑裡，對6例HLA A2.1陽性、表達AFP的HCC病人進行皮內免疫，5例病人對其中的3條表位肽顯示了 AFP肽特異性T細胞擴增。基礎研究表明，DC是體內功能最強的專職抗原遞呈細胞，但由於肝癌患者體內DC大多數處於不成熟狀態，其功能存在障礙，誘導同種異體淋巴細胞增殖的能力降低。通過體外誘導DC成熟，並負載AFP來源的表位肽，激活特異`性CTL殺傷肝癌細胞的能力。
[0004]哺乳動物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，適合表達完整的大分子蛋白。由哺乳動物細胞翻譯後再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝於原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近於天然蛋白質。由於近幾年生物技術公司對哺乳動物表達系統的研發，相應的已經推出了較好的表達系統，大大提高了外源蛋白在哺乳系統裡的表達量。隨著懸浮系統的日益成熟化，現在大規模瞬時表達外源蛋白已經成功，目前已經能達到mg至g級別。中國倉鼠卵巢細胞CHO作為表達宿主，其優勢有以下幾點:遺傳背景清楚，生理代謝穩定；與人的親緣關係接近，外源蛋白修飾準確；基因轉移和載體表達系統完善；耐受剪切力，便於大規模培養；被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞。DNA序列的密碼子優化是一項基因優化技術，通過優化重組蛋白AFP在CHO系統中的DNA序列，從而提高在CHO系統中的表達量。
[
【發明內容】
]
[0005]為了能夠大規模的製備高純度的AFP蛋白，本發明提供一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白及其製備的方法。
[0006]為實現上述目的，設計一種人工信號肽-AFP-609aa_6his的重組蛋白，其特徵在於其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。其DNA序列在CHO細胞中的表達量增高25倍。
[0007]人工信號肽的鹼基序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本發明還包括一種用哺乳動物瞬時表達系統體外表達所述重組蛋白的方法，包括重組蛋白基因的合成，
[0009]其特徵在於該方法包含以下步驟:
[0010]a.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，並進行質粒抽提，
[0011 ] b.將抽提得到的PCDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達，
[0012]c.7天後分離純化得到的重組蛋白
[0013]合成所述重組蛋白是在誘導型啟動子的控制下表達的。
[0014]上述的重組蛋白能應用於肝癌治療藥物。
[0015]本發明主要包含五個方面的內容:(I)優化重組AFP在CHO中表達的DNA序列(2 )利用基因合成技術，合成重組AFP DNA序列，然後將序列克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP質粒，大規模製備pcDNA3.1+-AFP質粒；(3)使用CHO懸浮表達系統表達重組AFP蛋白；(4)使用N1- NTA柱從懸浮細胞上清液中分離純化重組AFP蛋白。(5)將純化後AFP蛋白刺激樹突狀細胞(d`endritic cells, DC),用活化後的DC細胞將T細胞激活，形成CTL殺傷HepG2細胞，用MTT法檢測殺傷率。
[0016]本發明目的通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統製備的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的汙染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0017]圖1是哺乳動物表達系統的質粒PCDNA3.1+圖譜，
[0018]圖2是pcDNA3.1+-AFP的酶切鑑定瓊脂糖電泳圖，
[0019]圖3是SDS-PAGE分析純化後重組AFP蛋白圖，
[0020]圖4是Western-blot分析純化後重組AFP蛋白圖，
[0021 ] 圖5是MTT法檢測經CTL處理的!fepG2細胞生長數據圖。
[0022]圖1中的圖譜的具體信息為:
[0023]CMV 啟動子(CMV promoter):bases232-819
[0024]T7 啟動子 / 引物綁定位點(T7promoter/priming site):bases863_882 多克隆位點(Mutiple cloning site):bases895-1010
[0025]反鏈的引物結合位點(pcDNA3.1/BGH reverse priming site):basesl022_1039
[0026]BGH 多腺苷酸序列(BGH polyadenylation sequence):basesl028_1252
[0027]fI 複製起始位點(florigin):basesl298_1726
[0028]sv40早期啟動子和複製起始位點(SV40early promoter andorigin):basesl731_2074[0029]新黴素抗性基因(開放讀碼框)Neomycin resistancegene (ORF):bases2136_2930
[0030]SV40 多腺苷酸信號(SV40polyadenylation signal):bases3104-3234
[0031]PUC 複製起始位點(pUC origin):bases3617_4287 (互補鏈 complementarystrand)
[0032]氨卡青黴素抗性基因Ampicillin resistance gene (bla):bases4432_5428(互補鏈 complementary strand)
[0033]開放讀碼框(ORF):bases4432-5292 (互補鏈 complementary strand)
[0034]核糖體結合位點(Ribosomebinding site):bases5300_5304 (互補鏈complementary strand)
[0035]Bla 啟動子 Bla promoter (P3):bases5327_5333 (互補鏈 complementary strand)[【具體實施方式】]
[0036]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明。本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0037]實施例1:
[0038]1.研究材料:重組質粒PUC57-AFP為外包服務公司提供；DNA marker、限制性內切酶、T4連接酶等均購於Takara ；pcDNA3.1+、CHO-S和N1-NTA樹脂均為Invitrogen公司產品；CHO-S細胞培養基FreeStyle CHO均為Gibco的產品。PEI為Polysciences產品。
[0039]2.工作流程:
[0040](1)優化重組AFP在CHO中的DNA表達序列:主要在轉錄、翻譯以及蛋白摺疊三個方面進行優化。轉錄效率優化:優化GC含量；SD序列；TATA框；終止信號；CpG 二核苷酸含量。翻譯效率優化:優化密碼子在CHO中的偏好性；mRNA 二級結構；PolyA早期信號；抑制位點；RNA不穩定基序。蛋白摺疊效率優化:優化RNA二級結構；密碼子上下文關聯；密碼子與反密碼子交互作用。
[0041](2)將優化的DNA序列交由外包服務公司合成，構建重組質粒PUC57-AFP，酶切位點為 Hind III和 EcoR I。
[0042](3)通過Hind III和EcoR I雙酶切pUC57_AFP，將切下的AFP通過T4連接酶插入至同樣由Hind III和EcoR I雙酶切的pcDNA3.1+,構建成表達載體pcDNA3.1+-AFP。
[0043](4)製備感受態DH5 α，轉化pCDNA3.1+-AFP,平鋪在LB Amp+培養板，37°C孵箱過夜。挑3個單克隆，置5ml LB培養液中，37 °C快搖過夜。小抽5ml培養物並且用小量抽提產物酶切鑑定，選取陽性克隆的培養物。選取一個陽性克隆進行500ml過夜擴增培養，然後把菌液倒進無菌離心管中，4°C離心，6000g離心15分鐘。按照大抽試劑盒標準操作流程進程質粒大抽，最後得到2.5mg無菌，聞超螺旋,低內毒素，A260/280=l.82的聞質量的質粒。Hind III和EcoR I，1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。結果顯示片段準確。電泳結果在2000bp處有外源片段，表明了重組轉移質粒構建成功，如圖2所示。
[0044](5)轉染前24h，接種IL密度為0.8xl0~6/ml懸浮細胞CH0-S。轉染當天，細胞計數，確保細胞密度為2xl0~6/ml可以進行轉染。準備DNA-PEI混合物，室溫靜置IOmin後，將混合物加入到細胞中，放入37°C、5% CO2孵箱培養。24h後，添加TN1。培養六天後，取出細胞懸液。
[0045](6)細胞懸液進行離心，過濾。將上清液利用N1-NTA柱分離純化獲得相應的蛋白質，並通過SDS-PAGE以及Western blot分析純蛋白純度。結果在70kD處有條帶並且純度達到了 95%以上，表明了重組AFP蛋白表達成功如圖3和圖4所示。
[0046](7)應用血細胞分離機採集健康供者外周血單個核細胞30ml。採用Ficoll密度梯度分離的方法分離單個核細胞(PBMC)。用生理鹽水洗滌細胞，洗滌後的PBMC懸浮於1640無血清培養基中，置於六孔板中，每孔2ml，細胞濃度為2xl0~6/ml。37°C、5% CO2孵箱培養2h，保留貼壁細胞，收集非貼壁細胞，作為淋巴細胞，凍存。每孔加入含有1000u / mlrhGM-CSF、50ng / ml IL-4RPM1-1640培養液2ml，37°C、5% CO2孵箱培養。第五天加入純化後0，50，100，150ug/ml rAFP刺激DC，24小時後加入TNF_a刺激DC趨化成熟。第七天收集細胞，然後用生理鹽水連續洗滌三次。
[0047](8)收集DC細胞作為刺激細胞。復甦凍存的非貼壁細胞作為反應細胞。將反應細胞與刺激細胞按20:1比例混合接種於24孔板，每孔I ml，37°C、5% CO2培養5d，收集的細胞即為效應細胞。收集對數生長期的HepG2細胞作為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按20:1比例混合接種於96孔板，終體積200u I。同時設單一靶細胞組，單一效應細胞，每組設3復孔。37°C>5% 0)2培養2處後，加入町1'(終濃度0.51^/1111)，371:、5(% CO2培養4h，1000rpm / min離心5min,吸棄200ul上清,補入150ul DMS0,振蕩IOmin,充分溶解藍色沉澱後，用酶聯免疫檢測儀在490nm處檢測A490值。根據吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=[實驗組A均值一背景組A均值]/ [空白組A均值一背景組A均值]X 100%。其結果如圖5所示。`
【權利要求】
1.一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白，其特徵在於其DNA序列如SEQ IDNO:1所示。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特徵在於人工信號肽的鹼基序列如SEQID NO:2所示。
3.一種用哺乳動物瞬時表達系統體外表達權利要求1所述重組蛋白的方法， 包括所述重組蛋白基因的合成， 其特徵在於該方法包含以下步驟: a.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，並進行質粒抽提，b.將抽提得到的pcDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達， c.7天後分離純化得到的重組蛋白。
4.根據權利要求3中的方法，其特徵在於合成所述重組蛋白是在誘導型啟動子的控制下表達的。
5.一種權利要求1所述重組蛋白在肝癌治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103755811SQ201310683033
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2012年12月14日
【發明者】陸玲玲, 錢妮, 蘇國新, 葉永清 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司