一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法

2023-07-25 01:36:21 1

專利名稱：一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種多糖的提取方法，具體涉及一種聞效提取烏賊墨酸性多糖的方法，屬於功能性保健食品或生物醫藥領域。
背景技術：
多糖是存在於自然界中資源較為豐富的糖類，廣泛存在於植物、動物和微生物等有機體中。多糖作為一種幾乎無毒副作用的天然高分子提取物，在許多疾病的預防和治療方面，特別是一些頑固病、疑難病，如腫瘤、免疫力低下、高血糖、衰老、病毒性疾病等方面，有其自身獨特的功效。隨著科學技術的不斷進步，以及分子生物學和新藥物資源的研究與發展，多糖的研究越來越受到廣泛的重視，而多糖的研究報告也在逐年遞增。國內外學界普遍認為，正如蛋白質、核酸時代那樣，21世紀是「多糖生命科學」的時代。
由於多糖具有多種多樣的生物活性功能以及在功能食品和臨床上廣泛使用，使多糖生物資源的開發利用和研究日益活躍，成為天然藥物、生物化學、生命科學的研究熱點，到目前為止，已有300多種多糖類化合物從天然產物中被分離出來。然而，隨著陸地中草藥資源的日益匱乏，人類已將活性多糖的研究視角伸向廣袤且儲量豐富的海洋資源。烏賊是中國四大海產之一，近年來僅曼氏無針烏賊的年產量就達7萬噸。烏賊墨囊約佔其總比例10%，每年總量可達7千噸。在我國，烏賊墨囊一直作為廢棄物，造成資源浪費和環境汙染。我國醫藥對烏賊墨的認識與應用歷史悠久，最早見於明代的《本草綱目》，主要用於治療心絞痛。現代研究證實烏賊墨具有廣泛的生物學作用，如止血和治療婦科病、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗反轉錄病毒、抗菌、降血脂和升白等作用。近年來，我們發現烏賊墨具有較強的緩解化療藥物的毒副作用，弱化化療藥物對機體正常組織器官的毒性損傷。我們充分的前期研究結果和少量其他研究報導表明，多糖是烏賊墨中主要的活性成分，並且我們已經證實多糖具有明顯的化療保護作用。現已證明，多糖之所以具有廣泛的生物學功效，與其中所含酸性多糖直接相關，酸性多糖是其發揮功能的主要成分，甚至有報導認為，多糖中所含硫酸基團的多少決定了該多糖的功能強弱。烏賊墨是一種儲量豐富但被食品加工行業所廢棄的海洋活性物質，儘管目前已有少量的研究涉及其活性，甚至對其中多糖成分的活性研究，但對於其主要活性成分酸性多糖的提取製備及其生物學功能尚未見報導。在全球陸地資源日益珍貴的今天，從陸生植物開發天然活性多糖由於栽培的地理要求較嚴、產量低、原料價格高等因素，使得各種天然活性多糖的應用受到極大的限制，相對而言，海藻資源不會佔用農業用地，天然資源豐富，養殖成本較低，因此，烏賊墨資源的開發利用必將大有作為。因此，開發烏賊墨不僅可以變廢為寶獲得經濟效益，還能改善環境取得良好的社會效益，更重要的是藥源豐富，挖掘其潛在藥用價值對於充分利用海洋資源，擴大藥源具有深遠意義與廣闊的前景。

發明內容
本發明的目的在於提供一種高效、穩定、簡便的烏賊墨酸性多糖的製備方法。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案是
一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，包括如下步驟所述的烏賊墨酸性多糖是以烏賊墨為原料，解凍凍存的烏賊墨，用乙酸乙酯混勻，超聲波處理；抽濾去乙酸乙酯，冷凍乾燥獲得黑色粉末；人工神經網絡技術優化木瓜蛋白酶酶解參數，酶解物去蛋白後乙醇沉澱，冷凍乾燥後即獲得酸性多糖，具體步驟如下
(1)在3_5°C條件下解凍烏賊墨，與等體積的乙酸乙酯混勻，所述體積單位為毫升；
(2)將步驟(I)獲得的混合物超聲波處理，處理時間為4-6s，間隔8-12s，處理次數為15-25 次；
(3)將步驟(2)所得物於3-5°C條件下攪拌6-10h，用減壓抽濾法去除乙酸乙酯，冷凍乾燥處理得黑色烏賊墨粉末； (4)用木瓜蛋白酶酶解烏賊墨粉末，沸水浴滅活蛋白酶lOmin，離心後得上清液，上清液中加入氯仿/正丁醇混合液，磁力攪拌器攪拌20min,攪拌速度為1000 rpm,離心得上清液，上清液中加入4倍體積的無水乙醇，沉澱冷凍乾燥，即得烏賊墨酸性多糖；所述的木瓜蛋白酶和烏賊墨粉末的質量比為木瓜蛋白酶烏賊墨粉末=5 95 ;所述的上清液中加入氯仿/正丁醇(V/V=4/l)混合液的體積為上清液總體積的1/4 ;所述的上清液中加入氯仿/正丁醇混合液中兩者的比例為氯仿/正丁醇=4/1 ;所述的用木瓜蛋白酶酶解烏賊墨粉末的工藝參數採用人工神經網絡技術優化，其最佳處理參數為PH 7. O、酶解時間為7h，酶解溫度為52 °C，料液比為 I g/35ml ；
一種採用上述方法製備的烏賊墨酸性多糖；
所述的採用人工神經網絡技術，根據Box-behnken實驗設計對各項影響提取效率的因素進行優化。根據JMP軟體的神經網絡平臺及試驗數據，選擇「K摺疊」交叉驗證的方法擬合響應目標，交叉驗證組數K為5，過擬合罰項O. 001，歷程數20，最大迭代數50，收斂準則
O.00001。通過模型的決定係數R2及交叉驗證R2值確定隱藏節點數。通過對2-7個隱藏節點進行模型訓練，每次重複5次，顯示R2值隨著隱藏節點數的增加而增加，並趨近於1，交叉驗證R2先增加後下降，說明在隱藏節點超過3會出現擬合過度，而小於3導致擬合不足，因此選擇隱藏節點數為3，採用3X3X1結構的三層神經網，即3個輸入神經元，分別代表pH(Xl)、酶解時間(X2)、料液比(X3)，3個隱藏節點，I個輸出神經元，代表多糖的提取率Y。


圖1為烏賊墨酸性多糖的提取流程；
圖2為不同隱藏節點模型的R2及交叉驗證R2 ；
具體實施例方式下面結合附圖和實施例以及試驗數據來對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。實施例1
人工神經網絡技術優化製備工藝
(I)取冷凍的烏賊墨4°C下解凍，加入等體積乙酸乙酯，超聲波處理(處理時間5s，間隔10s，次數20次)，浸泡8h;(2)採用減壓抽濾去除浸泡的有機溶劑乙酸乙酯，將烏賊墨冷凍乾燥處理得黑色粉
末；
(3)根據Box-behnken試驗設計,如表1、2;
(4)稱取Ig的烏賊墨粉末，直接加入5%的木瓜蛋白酶粉劑(相對烏賊墨粉末的重量而言)，在52°C條件下，按上述設計方案加入料液比，調節pH，控制酶解時間；
(5)酶解時間到後在沸水浴下滅酶IOmin,離心(5000rpm,IOmin) 2-3次去除沉澱；
(6)採用Sevag法去除蛋白(即加入1/4體積的氯仿/正丁醇，體積比4在磁力攪拌器上搖勻20min，5000rpm離心lOmin，取上清液得到亮黃色的多糖液；
(7)採用50ml的比色管將得到的各個不同體積的烏賊墨多糖定容到50ml，採用蒽酮-硫酸法測定溶液中烏賊墨多糖的含量，並計算得率；
(8)通過模型的決定係數R2及交叉驗證R2值確定隱藏節點數如圖2；R2到達了 O. 99以上，說明實際值與預測值具有很好的相關性。表I為Box-Behnken試驗設計因素水平表
權利要求
1.一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，其特徵在於所述的烏賊墨酸性多糖是以烏賊墨為原料，解凍凍存的烏賊墨，用乙酸乙酯混勻，超聲波處理；抽濾去乙酸乙酯，冷凍乾燥獲得黑色粉末；人工神經網絡技術優化木瓜蛋白酶酶解參數，酶解物去蛋白後乙醇沉澱，冷凍乾燥後即獲得酸性多糖，具體步驟如下 (1)在3-5°C條件下解凍烏賊墨，與等體積的乙酸乙酯混勻； (2)將步驟(I)獲得的混合物超聲波處理，處理時間為4-6s，間隔8-12s，處理次數為15-25 次； (3)將步驟(2)所得物於3-5°C條件下攪拌6-10h，用減壓抽濾法去除乙酸乙酯，冷凍乾燥處理得黑色烏賊墨粉末； (4)用木瓜蛋白酶酶解烏賊墨粉末，沸水浴滅活蛋白酶lOmin，離心後得上清液，重複2次，上清液中加入氯仿/正丁醇混合液，磁力攪拌器攪拌20min，攪拌速度為1000 rpm,離心得上清液，上清液中加入4倍體積的無水乙醇，沉澱冷凍乾燥，即得烏賊墨酸性多糖。
2.根據權利要求1所述的一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，其特徵在於步驟(4)所述的木瓜蛋白酶和烏賊墨粉末的質量比為木瓜蛋白酶烏賊墨粉末=5 95o
3.根據權利要求1所述的一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，其特徵在於步驟(4)所述的上清液中加入氯仿/正丁醇(V/V=4/l)混合液的體積為上清液總體積的1/4。
4.根據權利要求1或3所述的一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，其特徵在於步驟(4)所述的上清液中加入氯仿/正丁醇混合液中兩者的比例為氯仿/正丁醇=4/1。
5.根據權利要求1或3所述的一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，其特徵在於步驟(4)所述的用木瓜蛋白酶酶解烏賊墨粉末的工藝參數採用人工神經網絡技術優化，其最佳處理參數為pH 7.0、酶解時間為711，酶解溫度為521，料液比為I g/35ml。
6.一種採用權利要求1所述的方法製備的烏賊墨酸性多糖。
全文摘要
本發明涉及一種高效提取烏賊墨酸性多糖的方法，該方法是將凍存的烏賊墨解凍，用乙酸乙酯混勻後超聲波處理，浸泡，減壓抽濾去乙酸乙酯，冷凍乾燥得烏賊墨粉末；再將該粉末用木瓜蛋白酶在最佳參數條件下酶解，滅酶，去蛋白，用無水乙醇沉澱，冷凍乾燥後即獲得烏賊墨酸性多糖；本發明利用神經網絡技術優化提取參數，結合木瓜蛋白酶酶解技術，實現了高效製備烏賊墨酸性多糖，相對提取效果達到91.4%；本方法操作簡單方便，提取率高，為今後烏賊墨酸性多糖的開發研究提供理論依據，也將更好的促進烏賊墨酸性多糖在醫藥，功能保健食品等方面的開發，具有廣泛的市場前景。
文檔編號C08B37/00GK103012615SQ201310005080
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月8日 優先權日2013年1月8日
發明者羅萍 申請人:廣東海洋大學