降解十二烷基硫酸鈉的沙雷氏菌及其應用的製作方法
2024-03-01 15:11:15
本發明涉及一種能高效降解十二烷基硫酸鈉的沙雷氏菌及其應用，屬於環境微生物應用技術領域。
背景技術：
表面活性劑(Surface active agen，surfactant)是指分子中同時含有親水基團和疏水基團，並在較低濃度時能顯著降低介質表面張力的一類化合物。目前，人工合成的表面活性劑廣泛應用於工農業生產中，如洗滌劑、農用化學噴霧等，致使大量的表面活性劑殘留於環境中，造成日益嚴重的環境汙染。有研究表明，表面活性劑有可能破壞細胞組織，引起人體過敏、農作物老化早衰，汙染水質並毒害水生生物。
十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate SDS)是一種重要的陰離子表面活性劑，極易溶於水，在液體洗滌劑及化學試劑工業生產中應用廣泛。SDS毒性較大且不易被降解，在環境中的大量累積對人體及水生生物具有潛在危害，易造成土壤及水體生態系統的破壞。研究表明，SDS對克氏原鰲蝦、斑馬魚、滷蟲等水生生物均有較強的毒害作用。
目前針對SDS的汙染治理主要有物理法、化學法和生物降解法。物理法(超濾、吸附、氣浮)設備簡單，但不能解決二次汙染問題。化學法處理費用較高，同時也存在二次汙染問題。在天然水體中，SDS的降解主要依賴於微生物作用，其降解速度與微生物濃度呈正比關係。利用微生物降解SDS具有安全、投資少，環境友好無二次汙染等優點。
近年來，已先後發現若干種對SDS具有降解效果的微生物，如湖南大學顏丙花等篩選的一株放線菌，72h對SDS的降解率達90.0％，蘭州大學李田等篩選的一株假單胞菌，在pH 6～9時對SDS的降解率達90.0％，關向傑等篩選的一株不動桿菌，對初始濃度400mg/L的SDS的降解率為94.0％。篩選高效菌株降解SDS已成為研究的趨勢和熱點，而目前關於生物降解SDS的研究中，尚沒有關於粘質沙雷氏菌降解能力的報導。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種能高效降解十二烷基硫酸鈉的沙雷氏菌。
同時，本發明還提供一種沙雷氏菌的應用。
最後，本發明再提供一種降解SDS的製劑。
為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是：
降解十二烷基硫酸鈉的沙雷氏菌，其名稱為粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1，保藏編號：CCTCC NO:M2015246，保藏日期：2015年4月24日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國武漢.武漢大學(湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心)。
粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1是從土壤中分離篩選出的一株細菌，近球形短杆狀，個體較小，革蘭氏陰性，不產芽孢。在LB平板上37℃培養菌落不透明，光滑、溼潤，呈白色，中心凸起，邊緣不規則；在LB平板上28℃培養產生紅色色素。生理生化實驗表明：該菌明膠液化實驗、糖醇發酵實驗(蔗糖、甘露醇、山梨醇)、V-P實驗結果均為陽性，甲基紅實驗、吲哚實驗結果均為陰性。16s rDNA測序結果顯示該菌16s rDNA序列(測序引物及序列詳見序列表)與粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens strain T237)同源性達99％。
沙雷氏菌的應用，具體為粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)在降解SDS中的應用，以及製備降解SDS製劑中的應用。
降解SDS的製劑，其包含粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)。
本發明的有益效果：
本發明粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)是從富含SDS的土壤中分離出的一株細菌，近球形短杆狀、個體較小，革蘭氏陰性，不產芽孢；在LB平板上37℃培養菌落不透明，光滑、溼潤，呈白色，中心凸起，邊緣不規則；在LB平板上28℃培養產生紅色色素。該菌能有效降解十二烷基硫酸鈉，可用於製備降解SDS的製劑。
保藏證明和存活證明說明
保藏菌株：粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1，保藏編號：CCTCC NO:M2015246，保藏日期：2015年4月24日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國武漢.武漢大學(湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心)。
附圖說明
圖1為粘質沙雷氏菌GW-1的形態圖。
具體實施方式
下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
實施例1
降解十二烷基硫酸鈉的沙雷氏菌的分離和篩選方法，包括以下步驟：
1)從開封市某洗衣粉生產廠家周邊取土樣20份，作為降解菌分離篩選的材料；
2)選用LB培養基，以稀釋塗布平板法對所採土樣進行菌株分離，共獲得162株細菌；
3)以LB培養基為基礎培養基，配製含不同濃度SDS(50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)的加富培養基；將已獲得的162株細菌分別劃線接種於含不同濃度SDS的加富培養基平板上，37℃過夜培養，通過觀察菌株生長情況對菌株進行初步篩選，篩出5株對高濃度SDS穩定耐受的細菌；
4)分別將以上5株細菌接種於降解率測定用培養基(200mg/L SDS，5g/L葡萄糖，餘量為水)中，37℃培養48小時；採用亞甲基藍法測定不同菌株對SDS的降解率，經比較得到SDS降解能力最為突出的菌株GW-1。
沙雷氏菌的鑑定分類
1)細胞形態及理化檢驗
粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1近球形短杆狀、個體較小，革蘭氏陰性，不產芽孢。在LB平板上37℃培養菌落不透明，光滑、溼潤，呈白色，中心凸起，邊緣不規則；在LB平板上28℃培養產生紅色色素。
生理生化實驗表明：該菌明膠液化實驗、糖醇發酵實驗(蔗糖、甘露醇、山梨醇)、V-P實驗結果均為陽性，甲基紅實驗、吲哚實驗結果均為陰性。
2)16s rDNA基因序列
純化菌株GW-1，取單菌落劃線培養，利用引物27F、1492R(見序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)擴增16s rDNA基因序列，並送上海生工生物技術服務公司進行測序，測序結果見序列表中SEQ ID NO.3。結果顯示，該菌16s rDNA序列與粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens strain T237)的同源性達99％。
試驗例
1、沙雷氏菌的培養：
1)試管斜面培養
配製LB培養基(配方為：2％酵母提取物，1.5％蛋白腖，2％葡萄糖，2％NaCl，1.8％瓊脂，pH7)，製備試管斜面，將粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)接種到試管斜面上，於37℃下培養2天獲得試管種。
2)培養皿劃線培養
採用上述LB培養基倒平板，劃線接種粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)，於37℃下培養24h，獲得用於液體培養的單菌落。
2、沙雷氏菌對SDS的降解試驗
1)降解率測定用培養基
降解率測定用培養基的配方如下：200mg/L SDS，5g/L葡萄糖，餘量為水。
2)降解率測定方法
配製降解率測定用培養基，分裝至250mL三角瓶中，裝樣量為50mL/瓶。將粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)單菌落接種於滅菌後的培養基中，37℃、200rpm振蕩培養，48h後取樣，將培養物於8000rpm離心20min，取上清液於三角瓶中，測定SDS濃度，並計算菌種對SDS的降解率。
SDS濃度測定採用亞甲基藍分光光度計法，將待測樣品稀釋至標準曲線所測濃度範圍，滴加幾滴酚酞為指示劑，滴加4％NaOH至水溶液呈紫紅色，再滴加3％H2S04使紅色剛好褪去。取200μL調好pH值的溶液加入1.5mL離心管中，再向離心管加入50μL亞甲基藍(5％的亞甲藍溶液，在使用前1:10稀釋)，最後再加入600μL氯仿，4000rpm離心5min。取氯仿相用分光光度計在650nm測吸光度。
分光光度法背景對照為不含SDS的降解率測定培養基。
3)降解率計算方法
SDS降解率＝(Cck－Ct)/Cck×100％，其中Cck為空白處理中SDS的濃度，Ct為振蕩培養若干天后殘留的SDS濃度。
4)試驗結果
亞甲基藍分光光度計發測定SDS濃度需要先製作標準曲線，試驗得到標準曲線為：y＝0.06106x+0.03767，R2＝0.99923。根據標準曲線計算48h後SDS濃度為12.1mg/L，代入降解率計算公式得到降解率為93.95％。
實施例2
沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)在降解SDS中的應用，具體為：取粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)擴大培養，收集菌體，投加菌體及少量葡萄糖到含有SDS的汙水中即可。
實施例3
降解SDS的製劑，其製備步驟為：取粘質沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)擴大培養，收集菌體，加甘油凍存(常規操作)即可。