一種提高靈芝菌發酵物中β-葡聚糖產量的方法

2023-07-18 01:44:16 1

一種提高靈芝菌發酵物中β-葡聚糖產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高靈芝菌發酵物中β-葡聚糖產量的方法，採用中國普通微生物菌種保藏管理委員會保藏的靈芝菌種(Ganoderma lucidum)，菌株保藏號為CCGMC 5.0616，接種靈芝種子液後，在溫度為27-30℃、轉速為150-200r/min的迴轉式搖瓶櫃中深層發酵2-5天，補加地鱉蟲油50-80mg/L後，在溫度為26-28℃、轉速為150-200r/min條件下繼續發酵6-9天結束，本發明方法的β-葡聚糖產量高達193.6mg/L。
【專利說明】一種提高靈芝菌發酵物中β-葡聚糖產量的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於真菌發酵【技術領域】，具體涉及一種提高靈芝β-葡聚糖產量的發酵工藝。

【背景技術】
[0002]靈芝(Ganodemalucidum(W.Curtis.:Fr.)P.Karst.)是最為名貴的森林大型真菌之一，在古代被稱為「仙草」。現代藥理學研究表明，靈芝具有很高的保健和藥用價值。《中華人民共和國藥典》早已正式收載靈芝為藥品；衛生部也批准靈芝為食品新資源；《美國草藥藥典與治療概要》也正式收載了靈芝。靈芝的研究已得到亞洲諸多國家，以及加拿大、美國和一些歐洲國家的重視。
[0003]靈芝的有效化學成分一直是人們關注的焦點。現已證實靈芝多糖和三萜是靈芝的關鍵藥效成分。近十餘年來，國內外學者對靈芝多糖的結構和藥理作用進行了大量研究，揭示主鏈具有β - (I — 3) -D、β - (I — 6) -D、β - (I — 4) -D結構的靈芝β -多糖，特別是靈芝β -葡聚糖具有顯著的生物活性，如具有調節免疫、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗衰老等功能，是靈芝發揮藥效的重要物質基礎之一。目前市場上僅有靈芝粗多糖(多糖提取物)或為靈芝總多糖相關產品，而靈芝β_葡聚糖及相關產品在國內外市場上很少，具有廣闊的市場開發前景。
[0004]現階段，獲取靈芝相關產品有三種途徑，一是從野生靈芝中獲取，二是人工栽培靈芝子實體，三是通過現代生物發酵技術獲得靈芝菌體和培養液(兩者合稱發酵菌物)。由於野生靈芝稀少，而傳統的人工栽培方法周期長，產量低，β_葡聚糖含量低，β_葡聚糖生產成本極高，無法滿足市場需要。而液體深層發酵技術生產靈芝具有生產周期短、產品質量和產量容易調控等特點，目前已成為獲取靈芝及其活性物質的最有效方法。近年來，靈芝的液體發酵技術取得了很大進展，但都集中在靈芝總多糖的發酵技術研究方面，而靈芝葡聚糖發酵技術的研究十分薄弱，靈芝葡聚糖的產量很低。近二十年來，真菌葡聚糖作為高效的生物反應調節因子(BRM)，具有重要的研究價值和廣闊的開發前景。因此，如何進一步提高靈芝中β -葡聚糖的產量，同時降低生產成本、提高經濟效益，已成為加快靈芝產品產業化進程亟待解決的問題。
[0005]已有通過發酵法生產靈芝中總多糖和靈芝酸(靈芝三萜)的技術，但缺乏液體發酵法生產靈芝β -葡聚糖的技術，如:
[0006]文獻:陳功明.靈芝多糖的液體發酵、提取純化及其硫酸化改性研究.碩士學位論文，浙江大學，2010.報導了通過液體發酵技術生產靈芝多糖，以及對產品進行提取和純化的方法，同時試驗了對多糖進行硫酸化改性的技術。但沒有針對β_葡聚糖進行液體發酵和提取純化研究。
[0007]文獻:王慧傑，李宇偉，連瑞麗，王志強，馬愛民.靈芝多糖液體發酵條件優化(食用菌學報，2007)報導了從一系列靈芝菌種中篩選出多糖產量高、生長快的靈芝菌株，研究了不同氮源、碳源及金屬離子對靈芝產多糖的影響，以及多糖液體發酵條件的優化技術，仍屬於靈芝總多糖的發酵技術，未涉及靈芝β -葡聚糖的發酵技術。
[0008]文獻:肖雷，姚菁華，呂兆啟，譚才鄧，廖延智，吳裕豪，龔燕媚，肖虹，吳曉燕，李平凡.靈芝液體發酵產胞內多糖的培養基優化(現代食品科技，2013)報導了靈芝在液體發酵過程中胞內多糖的培養基優化技術。也沒有β_葡聚糖的的發酵技術和相關提高產量的技術。
[0009]中國專利:偉張，湯亞傑，申請號200810007833，提出了一種促進靈芝酸和靈芝多糖生物合成的發酵方法。該方法分別考察了 pH兩階段、溶氧兩階段控制策略或補料策略相互協同在一起後對靈芝酸和靈芝多糖生物合成的影響，提出一種促進靈芝酸和靈芝多糖生物合成的發酵方法。但研究對象仍是靈芝總多糖，未涉及靈芝β_葡聚糖。
[0010]中國專利:山東省農業科學院土壤肥料研究所，申請號2010102306901，提出了一種提高靈芝多糖產量的液體發酵方法。它利用靈芝細胞的液體培養，通過在培養基中添加稀土元素鐠、釹或鑭，提高靈芝多糖的產量，但仍是針對總多糖的技術，沒有具體針對靈芝β-葡聚糖。
[0011]地鰵蟲是鰵蠊科昆蟲地鰵(Eupolyphaga sinensis Walker)的雌蟲乾燥體，是我國傳統的藥用昆蟲。我們通過大量的實驗發現，靈芝總多糖含量高時，靈芝的β_葡聚糖的量不一定最高。同時通過大量的篩選實驗，找到了一種能針對性提高靈芝β_葡聚糖產量的蟲類外源添加物質，即地鱉蟲油，並對發酵策略及液體培養基進行了優化設計，形成了一種能顯著提高靈芝發酵菌物中β_葡聚糖產量、且生產工藝簡易的β_葡聚糖生產工藝，即發酵模式為發酵一段時間後補加β_葡聚糖產物促進因子(地鱉蟲油)的全新的靈芝β-葡聚糖發酵技術。


【發明內容】

[0012]本發明的目的在於針對現有真菌β -葡聚糖發酵技術存在的種種不足，提供一種能顯著提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量、且生產工藝簡單、發酵時間相對較短的β_葡聚糖生產工藝。
[0013]為實現本發明目的，本發明的技術方案是:
[0014]—種提高靈芝菌發酵物中β -葡聚糖產量的方法:在靈芝(Ganoderma Iucidum)菌種液體發酵過程中添加地鱉蟲油。
[0015]地鱉蟲油的製備方法為，:蟲體風乾後，粉碎成細粉，用乙醚回流提取，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶劑後，獲得地鱉蟲液態油。
[0016]地鱉蟲油的更加具體的製備方法為:蟲體自然風乾後，粉碎成40-80目的細粉，用料液比為1:30-1:50g/mL的無水乙醚溶液在溫度為20-33°C下回流提取2_3小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶劑後，獲得地鱉蟲液態油。
[0017]上述方法中添加地鱉蟲油的量為50_80mg/L。而且是將靈芝種子液接種到液體發酵培養基中深層發酵後，再添加地鱉蟲油繼續發酵。
[0018]具體是將靈芝種子液接種到液體發酵培養基中深層發酵2-5天後添加地鱉蟲油，在溫度為26-28°C、轉速為150-190r/min繼續發酵6_9天結束。
[0019]將靈芝菌種接種到蔗糖為碳源，蛋白腖為氮源，KH2PO4和MgSO4為礦物元素的種子培養基中，培養基組成為:蔗糖36-45g/L，蛋白腖6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然後在溫度為27-30°C、轉速為160-200r/min的搖瓶中發酵6_9天(裝液量為容器體積的50-70% )，獲得靈芝的種子液。
[0020]添加地鱉蟲油之前先將靈芝種子液製備成菌體濃度為1.5-2.0g/L(以菌體乾重計)的接種液，按體積比10-15%的比例接種到液體發酵培養基中深層發酵2-5天(裝液量為容器體積的50-70% )。具體是將靈芝種子液製備成的接種液接種到蔗糖為碳源，蛋白腖為氮源，KH2PO4和MgSO4為礦物元素的液體發酵培養基中，培養基組成為:蔗糖40-46g/L，蛋白腖 6-9g/L，KH2PO4L 6g/L,MgSO40.76g/L ;然後在溫度為 27_30°C、轉速為 160_200r/min的搖瓶中深層發酵2-5天。本發明採用的靈芝菌株保藏號為CCGMC 5.0616。
[0021]本發明靈芝菌發酵物中β -葡聚糖提取和檢測方法為:在發酵產物(菌體和發酵液)中加入4倍體積的飲用自來水,在85°C下回流提取3小時，5000r/min離心15min,除去菌體殘渣，上清液在旋轉蒸發器中濃縮至原體積的1/4，再加入4倍體積的工業酒精，沉澱獲得總多糖。總多糖溶解於80°C熱水溶液後，在溶液中加入Sevage試劑[氯仿:正丁醇=5:1 (v/v)]，振蕩，離心棄去多糖中的蛋白等雜質，然後用剛果紅比色法定量β -葡聚糖的含量。本發明採用中國普通微生物菌種保藏管理委員會保藏的靈芝(靈芝)菌種(Ganoderma Iucidum),菌株保藏號為CCGMC 5.0616。菌種的有關性質可以參閱中國普通微生物菌種保藏管理委員會(CCGMC)菌種目錄，本發明不再詳述。
[0022]與現有靈芝發酵技術相比，本發明具有以下優勢:
[0023]I)本發明涉及的靈芝發酵技術針對性強，具體針對靈芝β_葡聚糖的現代發酵技術，不是傳統的靈芝總多糖的發酵技術。
[0024]2)通過在靈芝發酵一段時間後補加適量的地鱉蟲油，可顯著提高靈芝發酵菌物中β_葡聚糖的產量，其產量高達193.6mg/L，遠遠高於未添加地鱉蟲油的傳統發酵的產量。
[0025]3)本發明的發酵工藝簡單，且葡聚糖總的發酵時間較短，生產效率明顯提高，適合工業化生產。
[0026]4)本發明添加的是可食用的地鱉蟲油，且添加量很少，無毒副作用。

【具體實施方式】
[0027]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0028]實施例1:
[0029]地鱉蟲油的製備:蟲體自然風乾後，粉碎成60目的細粉，用料液比為1:30 (m/v)的無水乙醚溶液在溫度為25°C下回流提取2.3小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶濟後，獲得地鱉蟲液態油。
[0030]靈芝β_葡聚糖發酵:採用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ganoderma Iucidum),保藏號:CCGMC 5.0616。
[0031]靈芝種子培養基組成:蔗糖37g/L，蛋白腖8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液體發酵培養基組成:蔗糖40g/L，蛋白腖7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。將菌絲塊接種於含1.2L種子培養基的2L搖瓶中，在發酵溫度為29°C、轉速為180r/min的迴轉式搖瓶櫃中發酵8天，獲得種子液，以無菌水調成2.0g/L的濃度(以菌體乾重計)，然後接種120mL種子液於含1.2L發酵培養基的2L搖瓶中。發酵溫度為29°C，轉速為190r/min，先發酵2天，然後一次性補加60mg/L地鱉蟲油，在發酵溫度為28°C，轉速為170r/min條件下繼續發酵7天，結束髮酵，收穫發酵物。
[0032]在發酵產物(菌體和發酵液)中加入4倍體積的飲用自來水，在85°C下回流提取3小時，5000r/min離心15min,除去菌體殘洛,上清液在旋轉蒸發器中濃縮至原體積的1/4,再加入4倍體積的工業酒精，沉澱獲得總多糖。總多糖溶解於80°C熱水溶液後，在溶液中加入Sevage試劑[氯仿:正丁醇=5:1 (V/V)],振蕩,離心棄去多糖中的蛋白等雜質,然後用剛果紅比色法定量β_葡聚糖的含量。結果β_葡聚糖的產量為171.9mg/L。
[0033]實施例2:
[0034]地鱉蟲油的製備:蟲體自然風乾後，粉碎成80目的細粉，用料液比為1:40 (m/v)的無水乙醚溶液在溫度為30°C下回流提取2.5小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶濟後，獲得地鱉蟲液態油。
[0035]靈芝β_葡聚糖發酵:採用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ganoderma Iucidum),保藏號:CCGMC 5.0616。
[0036]種子培養基組成:蔗糖40g/L，蛋白腖8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液體發酵培養基組成:蔗糖42g/L，蛋白腖7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。將菌絲塊接種於含1.2L種子培養基的2L搖瓶中，在發酵溫度為27°C、轉速為180r/min的迴轉式搖瓶櫃中發酵9天，獲得種子液，以無菌水調成2.0g/L的濃度(以菌體乾重計)，然後接種120mL種子液於含1.2L發酵培養基的2L搖瓶中。發酵溫度為28°C，轉速為180r/min，先發酵5天，然後一次性補加70mg/L地鱉蟲油，在發酵溫度為27°C，轉速為160r/min條件下繼續發酵5天，結束髮酵，收穫發酵物。
[0037]產品的提取和分析方法同實施例1，結果β -葡聚糖的產量為166.lmg/L。
[0038]實施例3:
[0039]地鱉蟲油的製備:蟲體自然風乾後，粉碎成60目的細粉，用料液比為1:50 (m/v)的無水乙醚溶液在溫度為30°C下回流提取2小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶濟後，獲得地鱉蟲液態油。
[0040]靈芝β_葡聚糖發酵:採用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ganoderma Iucidum),保藏號:CCGMC 5.0616。
[0041]種子培養基組成:蔗糖39g/L，蛋白腖8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液體發酵培養基組成:蔗糖44g/L，蛋白腖7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。將菌絲塊接種於含1.2L種子培養基的2L搖瓶中，在發酵溫度為30°C、轉速為180r/min的迴轉式搖瓶櫃中發酵8天，獲得種子液，以無菌水調成1.8g/L的濃度(以菌體乾重計)，然後接種150mL種子液於含1.2L發酵培養基的2L搖瓶中。發酵溫度為30°C，轉速為190r/min，先發酵3天，然後一次性補加50mg/L地鱉蟲油，在發酵溫度為28°C，轉速為180r/min條件下繼續發酵7天，結束髮酵，收穫發酵物。
[0042]產品的提取和分析方法同實施例1，結果β -葡聚糖的產量為185.2mg/L。
[0043]實施例4:
[0044]地鱉蟲油的製備:蟲體自然風乾後，粉碎成60目的細粉，用料液比為1:50 (m/v)的無水乙醚溶液在溫度為32°C下回流提取2.8小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶濟後，獲得地鱉蟲液態油。
[0045]靈芝菌種、培養基組成、種子接種方法、接種量同實施例3。
[0046]接入種子液後，在發酵溫度為30°C，轉速為190r/min下，先發酵3天，然後一次性補加75mg/L地鱉蟲油，在發酵溫度為27°C，轉速為180r/min條件下繼續發酵7天，結束髮酵，收穫發酵物。產品的提取和分析方法同實施例1，結果β_葡聚糖的產量為179.3mg/L。
[0047]實施例5:
[0048]地鱉蟲油的製備方法、靈芝菌種、培養基組成、種子接種方法、接種量同實施例3。
[0049]接入種子液後，在發酵溫度為30°C，轉速為190r/min下，先發酵4天，然後一次性補加80mg/L地鱉蟲油，在發酵溫度為28°C，轉速為180r/min條件下繼續發酵6天，結束髮酵，收穫發酵物。產品的提取和分析方法同實施例1，結果β_葡聚糖的產量為182.7mg/L。
[0050]實施例6:
[0051]地鱉蟲油的製備方法、靈芝菌種、培養基組成、種子接種方法、接種量同實施例3。同時設立對照發酵組和補加地鱉蟲油發酵組。
[0052]對照發酵組在接入種子液後，在發酵溫度為30°C，轉速為190r/min下，先發酵3天；然後在發酵溫度為28°C，轉速為175r/min條件下繼續發酵7天後結束髮酵。
[0053]地鱉蟲油發酵組在接入種子液後，在發酵溫度為30°C，轉速為190r/min下，先發酵3天，然後一次性補加68mg/L地鱉蟲油，繼續在發酵溫度為28°C，轉速為175r/min條件下繼續發酵7天，結束髮酵，收穫發酵物。
[0054]產品的提取和分析方法同實施例1。結果對照組(未加地鱉蟲油)β_葡聚糖的產量為151.2mg/L，添加發酵組β -葡聚糖的產量為193.6mg/L。
【權利要求】
1.一種提高靈芝菌發酵物中β -葡聚糖產量的方法，其特徵在於:在靈芝(GanodermaIucidum)菌種液體發酵過程中添加地鱉蟲油。
2.根據權利要求1所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:地鱉蟲油的製備方法為:蟲體風乾後，粉碎成細粉，用乙醚回流提取，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶劑後，獲得地鱉蟲液態油。
3.根據權利要求2所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:地鱉蟲油的製備方法為:蟲體自然風乾後，粉碎成40-80目的細粉，用料液比為1:30-1:50g/mL的無水乙醚溶液在溫度為20-33°C下回流提取2_3小時，抽濾獲得乙醚提取液，用氮氣反覆吹乾乙醚溶劑後，獲得地鱉蟲液態油。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種提高靈芝菌發酵物中β-葡聚糖產量的方法，其特徵在於:添加地鱉蟲油的量為50-80mg/L。
5.根據權利要求4所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:將靈芝種子液接種到液體發酵培養基中深層發酵後，再添加地鱉蟲油繼續發酵。
6.根據權利要求5所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:將靈芝種子液接種到液體發酵培養基中深層發酵2-5天後添加地鱉蟲油，在溫度為26-28°C、轉速為150-190r/min繼續發酵6-9天結束。
7.根據權利要求5所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:將靈芝菌種接種到蔗糖為碳源，蛋白腖為氮源，KH2PO4和MgSO4為礦物元素的種子培養基中，培養基組成為:蔗糖36-45g/L，蛋白腖6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然後在溫度為27-30°C、轉速為160-200r/min的搖瓶中發酵6_9天，獲得靈芝的種子液。
8.根據權利要求5所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:將靈芝種子液製備成菌體濃度為1.5-2.0g/L的接種液，按體積比10-15%的比例接種到液體發酵培養基中深層發酵2-5天。
9.根據權利要求8所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:將靈芝種子液製備成接種液接種到蔗糖為碳源，蛋白腖為氮源，KH2PO4和MgSO4為礦物元素的液體發酵培養基中，培養基組成為:蔗糖40-46g/L，蛋白腖6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然後在溫度為27-30°C、轉速為160_200r/min的搖瓶中深層發酵2-5天。
10.根據權利要求1或2或3所述的一種提高靈芝菌發酵物中β_葡聚糖產量的方法，其特徵在於:靈芝菌株保藏號為CCGMC 5.0616。
【文檔編號】C12P19/08GK104357510SQ201410562487
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】王曉玲, 劉高強 申請人:中南林業科技大學