富含磷壁酸的肺炎鏈球菌的培養方法

2023-07-17 21:19:16 1

專利名稱：富含磷壁酸的肺炎鏈球菌的培養方法
技術領域：
本發明涉及病原微生物的培養，尤其涉及肺炎鏈球菌的培養方法。
背景技術：
肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)，屬於芽胞桿菌綱乳桿菌目鏈球菌科鏈球菌屬，是一 種革蘭陽性球菌，菌體呈矛頭狀，多成雙排列，寬端相對，尖端向外。在痰液、膿汁、肺組織病 變中亦可呈單個或短鏈狀。肺炎鏈球菌無鞭毛，無芽胞，在機體內或含血清的培養基中能形 成莢膜，莢膜需特殊染色才可見。肺炎鏈球菌經常寄居於正常人的鼻咽腔中，多數不致病或致病力弱，僅少數有致 病力。作為一種條件致病菌，肺炎鏈球菌通常形成帶菌狀態，當機體免疫力下降時，尤在呼 吸道病毒感染後或嬰幼兒、年老體弱者易發生肺炎鏈球菌肺部感染。肺炎鏈球菌主要引起 人類大葉性肺炎，約佔細菌性肺炎的80%。肺炎後可繼發胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳 突炎、副鼻竇炎、腦膜炎和敗血症等。肺炎鏈球菌的抗原主要包括1、莢膜多糖抗原是一類型特異性多糖抗原，根據莢膜多糖的不同，肺炎鏈球菌可 區分為約90多個血清型。莢膜多糖抗原可以誘導人體產生特異性抗體，對同型感染有保護 作用。針對肺炎鏈球菌的莢膜多糖疫苗、莢膜多糖-蛋白偶聯疫苗均已廣泛使用。2.菌體抗原(I)C多糖一種特異性多糖，存在於肺炎鏈球菌胞壁中，為各型菌株所共有。在 Ca2+存在時，肺炎鏈球菌C多糖可為血清中一種稱為C反應蛋白(C reactive protein ； CRP)的球蛋白所沉澱。C多糖在人體內可誘導產生高滴度抗體水平，但該抗體卻並沒有保 護性。(2)M蛋白是一種型特異抗原。C多糖是由重複單位組成的細胞壁磷壁酸，為肺炎鏈球菌的共同抗原，存在於所有 血清型肺炎鏈球菌的細胞壁中。在莢膜多糖疫苗、莢膜多糖-蛋白偶聯疫苗生產過程中，分 離純化的莢膜多糖不可避免的混雜有C多糖。為了精確定量疫苗中莢膜多糖的含量，需要 對莢膜多糖中混雜的C多糖進行檢測。在莢膜多糖疫苗效力評價方面，人體內存在的抗C多糖抗體常常幹擾對莢膜多糖 抗體的定量測定，例如用ELISA方法測定的抗莢膜多糖抗體數值偏高。經改進的ELISA檢 測方法，需要在測定前先用C多糖對血清樣本中的C多糖抗體進行吸附，以得出更加準確的 實驗結果。一般認為，C多糖由2-8個重複單位組成，每個重複單位由五個單糖結構構成，包 括一個葡萄糖、一個2-乙醯胺-4-氨基-2，4，6-三脫氧半乳糖(AAT)、兩個半乳糖胺和一個 5-磷酸核糖醇，重複單位之間通過磷酯鍵相連。在兩個半乳糖胺殘基上連接有磷酸膽鹼集 團，是C多糖的顯著特徵。不同的研究者報導的C多糖結構不完全相同，主要差異在於重複 單位中磷酸膽鹼的數量以及乙醯化程度。這種差異可能與肺炎鏈球菌的種類、菌體培養方法、C多糖的提取方法等多種因素有關。本領域迫切需要結構完整的C多糖樣品和/或對照品，用於肺炎鏈球菌多糖疫苗 或結合疫苗的質量控制以及相關檢測試劑的生產。因此，建立質量可控、重複性好、適合大 規模生產的肺炎鏈球菌培養、C多糖分離純化工藝具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種富含磷壁酸的肺炎鏈球菌的培養方法，該方 法培養的富含磷壁酸的肺炎鏈球菌用於C多糖樣品和/或對照品的製備。本發明提供了一種肺炎鏈球菌的培養方法，在特徵是在培養基中添加氯化膽鹼。在一個優選的方案中，培養基中添加的氯化膽鹼的濃度2. 5 200ug/ml ；優選的， 氯化膽鹼濃度為5 150ug/ml ；更優選的，氯化膽鹼濃度為20 80ug/ml ；最優選的，氯化 膽鹼濃度為40 80ug/ml。本發明的肺炎鏈球菌的培養方法，所用的培養基為商品TSB培養基；優選的，TSB 培養基在接種前補加1.0%葡萄糖。本發明所用的培養基還可以是自製複合培養基，所述的自製複合培養基包含氯化 鈉0. 25%、磷酸二氫鈉0. 1 %、磷酸氫二鉀0. 3%、硫酸鎂0. 041 %、氯化鈣0. 001 %、蛋白腖 1.0%、酵母浸出粉0.5%、葡萄糖1.0%。本發明的肺炎鏈球菌的培養方法，肺炎鏈球菌的培養為兩級或三級擴大培養，每 級培養接種後在37°C、CO2孵箱培養4 8小時；更優選的，肺炎鏈球菌的培養為三級擴大 培養，第一級、第二級培養接種後培養4 8小時，第三級培養在接種後培養6小時。本發明的肺炎鏈球菌的培養方法，肺炎鏈球菌菌株為粗造型肺炎鏈球菌突變體； 優選的肺炎鏈球菌菌株選自CSR SCS2 CloneU R6A、R36A或RSC-2 ；更優選的，肺炎鏈球菌 菌株為CSR SCS2 Clonel菌株。本發明的肺炎鏈球菌培養方法，獲得的肺炎鏈球菌生長狀態好，磷壁酸含量高，易 於大規模生產。用該培養方法獲得的肺炎鏈球菌提取的C多糖，結構完整，磷含量、氨基己 糖含量、糖醛酸含量等關鍵指標與參比C多糖(丹麥血清研究所提供)接近，適合作為肺炎 鏈球菌多糖疫苗、蛋白結合疫苗生產中C多糖檢測的對照品，也可用於評價肺炎鏈球菌多 糖疫苗、蛋白結合疫苗的檢測試劑。
具體實施例方式菌株常用於純化製備C-Ps的肺炎鏈球菌菌株包括CSR SCS2 Clone 1、R6A、R36A、RSC_2 等。本發明採用的肺炎鏈球菌菌株為CSR SCS2 Clonel，為一株II型肺炎鏈球菌的莢膜 突變株，因失去莢膜成為粗糙型(有莢膜則為光滑型)。也有研究報導稱在其細胞表面包 裹有一層C多糖「莢膜」層。使用CSR SCS2Cl0nel菌株在C多糖的分離純化中不受莢膜 多糖的幹擾，所以被多數研究者採用，例如Schiffman，G. et al, (1971)Capsulation of Pneumococcus with soluble cell wall-like polysaccharide. J. Exp. Med. 134,600-617. 以及S0rensen U. B. S. et al, (1984) C-polysaccharide in a pneumococcal vaccine. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 92 :351_356。
肺炎鏈球菌的鑑別(1)形態學觀察典型的肺炎鏈球菌為革蘭染色陽性球菌，直徑約1 μ m。常呈雙排列。菌體成矛頭 狀，寬端相對，尖端向外。在液體培養中可呈單個或短鏈狀。有毒株在體內形成莢膜。普通 染色時莢膜不著色，表現為菌體周圍透明環。無鞭毛。不形成芽胞。菌體衰老時，或由於自 溶酶(autolysin)的產生將細菌裂解後，可呈現革蘭染色陰性。(2)糖，醇生化反應肺炎鏈球菌可以在以乳糖、棉子糖或菊糖為碳源的培養基上生長，不能在以甘露 醇或山梨醇為碳源的培養基上生長，常用於肺炎鏈球菌的鑑別。(3)奧普託欣敏感試驗奧普託欣(Optochin，鹽酸乙基氫化羥基奎寧)對肺炎鏈球菌有特異抑制作用，其 作用機制可能是幹擾葉酸生物合成，而對其它鏈球菌則無此作用。常用於肺炎鏈球菌的鑑 別。(4)膽汁溶菌試驗膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，可能是由於膽汁降低細胞膜表面的張力，使細胞 膜破損或使菌體裂解；或者是由於膽汁激活了肺炎鏈球菌自溶酶，加速了肺炎鏈球菌本身 自溶過程，促使細菌發生自溶。主要用於肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑑別，前者陽性，後者 陰性。培養基本發明採用的固體血瓊脂培養基為含8%綿羊血的瓊脂培養基，可製作成斜面或 平板，為青島海博生物技術有限公司產品。本發明採用的液體培養基主要為兩種，主要成分及來源如下(1)複合液體培養基成份所述的複合培養基包含氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二 鉀、硫酸鎂、氯化鈣、蛋白腖、酵母浸出粉、葡萄糖，具體配比見下表。臨用前配製，分裝後8 磅30分鐘高壓滅菌，小三角瓶200ml，大三角瓶600ml，大立瓶9. 5L (1 %葡萄糖在接種時補 加)。表1複合培養基組分配比
權利要求
1.一種肺炎鏈球菌的培養方法，其特徵在於，在肺炎鏈球菌液體培養基中添加終濃度 為2. 5 200ug/ml的氯化膽鹼。
2.如權利要求1的培養方法，其特徵在於，所述的氯化膽鹼的終濃度為5 150ug/ml。
3.如權利要求2的培養方法，其特徵在於，所述的氯化膽鹼的終濃度為20 80ug/ml。
4.如權利要求3的培養方法，其特徵在於，所述的氯化膽鹼的終濃度為40 80ug/ml。
5.如權利要求1的培養方法，其特徵在於，所述的肺炎鏈球菌液體培養基為TSB培養基。
6.如權利要求5的培養方法，其特徵在於，所述的培養基添加終濃度為的葡萄糖。
7.如權利要求1的培養方法，其特徵在於，所述的肺炎鏈球菌液體培養基為自製培養 基，所述的自製培養基包含氯化鈉0. 25%、磷酸二氫鈉0. 1%、磷酸氫二鉀0. 3%、硫酸鎂 0. 041%、氯化鈣0. 001%、蛋白腖1.0%、酵母浸出粉0.5%、葡萄糖1.0%。
8.如權利要求1的培養方法，其特徵在於，肺炎鏈球菌的培養為兩級或三級擴大培養， 每級培養接種後在37°C、(X)2孵箱培養4 8小時。
9.如權利要求8的培養方法，其特徵在於，肺炎鏈球菌的培養為三級擴大培養，第一 級、第二級培養接種後培養4 8小時，第三級培養在接種後培養6小時。
10.如權利要求1的培養方法，其特徵在於，所述的肺炎鏈球菌為CSRSCS2Clonel菌株。
全文摘要
本發明涉及肺炎鏈球菌的培養方法。本發明的肺炎鏈球菌的培養方法，在液體培養基中添加氯化膽鹼，並對培養工藝進行了優化，獲得的肺炎鏈球菌菌體富含磷壁酸，特別適合作為提取肺炎鏈球菌C多糖的材料。
文檔編號C12R1/46GK102093963SQ201010564079
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月26日 優先權日2010年11月26日
發明者任珍芸, 沈榮 申請人:蘭州生物製品研究所