一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法

2023-07-07 09:41:21

專利名稱：：一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法
技術領域：
：本發明涉及一種測定硫含量的方法，具體涉及一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法。
背景技術：
：多糖硫酸酯(polysaccharidesulfate)是多糖大分子鏈中單糖分子上的某些羥基被硫酸根所取代而形成的一種化學結構複雜、生物活性多樣、構效關係鮮明的多糖衍生物，它包括從動、植物中提取的各種硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各種硫酸多糖如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、硫酸香菇多糖、巖藻依聚糖、卡拉膠硫酸軟骨素等。多糖硫酸酯具有廣泛的生物學性質，包括抗病毒、抗腫瘤、抗愛滋病、增強免疫系統功能和抗凝活性等，因而受到極大關注。取代度的高低直接影響多糖的活性，羥基的硫酸酯化，不僅增加了多糖的溶解性，更重要的是改變了多糖的構象，因此，多糖硫酸酯中硫酸根含量的測定是多糖硫酸酯構效關係研究的一個重要方面。現有的測定樣品中硫含量的方法有離子色譜法(IC)、硫酸鋇濁度法、元素分析法、X射線螢光(XRF)法、電感耦合等離子體-原子發射光譜法(ICP-AES)、原子吸收光譜法(AAS)和電化學分析法等。中國專利CN1811400A於2006年8月2日公開了一種"示波極譜法測定餾分油中元素硫含量"的方法，在樣品中加入三苯基磷使之與元素硫生成三苯基磷硫化物，根據所測溶液產生的極譜波峰電流值與其元素硫含量的相關性進行測定，此方法只適用於所針對的樣品，應用範圍窄。文獻"離子色譜法測定高山紅景天多糖硫酸酯中硫酸根含量的研究"(《分子科學學報》，2000，9，16(3))於2000年在《分子科學學報》16巻第3期報導了利用離子色譜法測定高山紅景天多糖硫酸酯中硫酸根含量的方法，樣品需灰化處理，該方法存在線性範圍較窄(l20mg/L)、重複性差等缺點。文獻"鹽酸水解-硫酸鋇重量法測定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法考察"(《食品科學》2002，(23)5，107111)於2002年在《食品科學》23巻第5期報導了鹽酸水解-硫酸鋇重量法測定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法，該方法操作煩瑣、雜質幹擾嚴重，由於水解時間、加入明膠-氯化鋇溶液等保溫時間的不同而使測定結果精確度和靈敏度都不理想，人們期望有一種能夠快速、準確地測定多糖硫酸酯中硫含量的方法。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、準確地測定多糖硫酸酯中硫含量的方法。為解決上述技術問題，本發明一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法，包括如下步驟(1)繪製標準曲線並建立回歸方程取一定質量的Na2S04定容於容量瓶中製備硫酸根(S042—)濃度為100mg/ml的母液，然後，依次稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的硫酸根梯度標準溶液。取此梯度標準溶液分別注入高效液相色譜(HPLC)檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，以峰面積平均值為縱坐標(Y)、硫酸根梯度標準溶液濃度為橫坐標(X)繪製標準曲線並建立回歸方程；(2)樣品的處理稱取待測多糖硫酸酯乾物質樣品，加入濃度為14mol/L的鹽酸，其中所述乾物質樣品與鹽酸的比例為，重量體積^mg:l~2ml，在IO(TC下氮氣保護水解46小時，然後在4060。C、0.060.08MPa下減壓濃縮蒸乾得到乾物質A;(3)樣品硫含量的測定將乾物質A用超純水溶解定容，使其硫酸根濃度在0.0510mg/ml範圍內，取所定容的樣品溶液注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，將峰面積平均值代入步驟(1)中所建立的回歸方程算出定容後樣品溶液的硫酸根濃度(mg/ml)，根據所定容樣品溶液中硫酸根的質量和所用多糖硫酸酯乾物質樣品的質量算出該乾物質樣品的硫酸根含量，最後由硫在硫酸根中的質量百分比(33.33%)算出該乾物質樣品的硫含量(質量百分比)。高效液相色譜參數色譜柱SephadexG-10柱；洗脫劑超純水；洗脫速率1ml/min;柱溫30°C;檢測器示差折光檢測器，檢測器溫度35'C;進樣量20ul;標準曲線的線性範圍0.0510mg/ml;檢出限0.01mg/ml。表1為實施例13的標準曲線數據，圖13分別為實施例13中以梯度硫酸根標準溶液濃度(X)對峰面積(Y)繪製的標準曲線。在實施例13中所建立的對應的回歸方程，其相關係數W值均接近於1，說明其對應的回歸方程都具有極顯著的線性相關關係。表1實施例13中各梯度硫酸根標準溶液所對應的HPLC檢測峰面積的平均值及各實施例中所建立回歸方程的^值硫酸根含量Cmg/ml)實施例1峰面積平均值實施例2峰面積平均值實施例3峰面積平均值0.050.17310.16420.16860.10.27810.27510.26630.51.20661.20611.202612.11522.10042,118211.698711.703211.68991022.036621.903522細5R20.99910.99890.9991表2給出了針對同樣的多糖硫酸酯乾物質樣品，本發明實施例測定的硫含量與元素分析儀測定的硫含量及硫酸鋇濁度法測定的硫含量的數據比較；此處硫酸鋇濁度法測定的結果由於受雜質的幹擾而使測定結果有所偏差，元素分析儀測定是在其他測試機構測定的，該測定是目前精確度較高的測定方法。本發明實施例的測定結果與元素分析儀測定的結果基本一致，說明本發明的測定結果是準確、可靠的。表2對於同樣的多糖硫酸酯乾物質樣品，本發明實施例的HPLC測定與元素分析儀測定及硫酸鋇濁度法測定的硫含量(％)數據比較tableseeoriginaldocumentpage6本發明的有益效果是在本發明一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法中，多糖溶液與流動相混合液的相溶性很好、標準曲線線性範圍較寬，克服了以往測定硫含量過程中操作煩瑣，雜質幹擾嚴重，精確性、靈敏度不理想，線性範圍較窄等缺點；本發明方法檢測結果準確可靠，重複性好，大大簡化了檢測步驟，不包括樣品水解預處理的時間，樣品一次測定的時間僅為15分鐘左右，節省了測定時間，測定費用低，易於推廣實施。下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。圖1為根據實施例1中數據製作的標準曲線；圖2為根據實施例2中數據製作的標準曲線；圖3為根據實施例3中數據製作的標準曲線；圖4為實施例3的測試樣品溶液的高效液相色譜圖，其中橫坐標為保留時間(min)，縱坐標為響應值(MV)。具體實施例方式下面的實施例可更詳細地說明本發明，但不以任何形式限制本發明。本發明的目的是提供一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法。在實際測定中，每測同一批樣品要求重新製作標準曲線。實施例l本發明一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法，包括如下步驟(1)繪製標準曲線並建立回歸方程稱取14.80gNa2S04定容於100ml容量瓶中製備硫酸根(S042—)濃度為100mg/ml的母液，然後，依次稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的硫酸根梯度標準溶液。取此梯度標準溶液分別注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，以峰面積平均值為縱坐標(Y)、硫酸根梯度標準溶液濃度為橫坐標(X)繪製標準曲線(圖l)並建立回歸方程Y二2.2175X+0.0979,R2=0.9991;(2)樣品的處理-準確稱取2mg待測多糖硫酸酯乾物質樣品，加入濃度為2mol/L鹽酸4ml，在10(TC下氮氣保護水解6小時，然後在6(TC，0.06MPa下減壓濃縮蒸餾得到乾物質A;(3)樣品硫含量的測定將乾物質A用超純水溶解定容至2ml，取所定容的樣品溶液注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，將峰面積平均值0.5347代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y二2.2175X+0.0979)算出定容後樣品溶液的硫酸根濃度0.1970mg/ml，根據所定容樣品的體積2ml和所用多糖硫酸酯乾物質樣品的質量2mg算出該乾物質樣品的硫酸根含量19.70%，最後由硫在硫酸根中的質量百分比(33.33%)算出該乾物質樣品的硫含量6.57%。實施例2本發明一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法，包括如下步驟(1)繪製標準曲線並建立回歸方程稱取14.80gNa2S04定容於100ml容量瓶中製備硫酸根(S042—)濃度為100mg/ml的母液，然後，依次稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的硫酸根梯度標準溶液。取此梯度標準溶液分別注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，以峰面積平均值為縱坐標(Y)、硫酸根梯度標準溶液為橫坐標(X)濃度繪製標準曲線(圖2)並建立回歸方程Y-2.2063X+0.1028,R2=0.9989;(2)樣品的處理準確稱取2mg待測多糖硫酸酯乾物質樣品，加入濃度為1mol/L鹽酸2ml，在10(TC下氮氣保護水解4小時，然後在4(TC、0.08MPa下減壓濃縮蒸餾得到乾物質A;(3)樣品硫含量的測定將乾物質A用超純水溶解定容至lml，取所定容的樣品溶液注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，將峰面積平均值(Y)1.9166代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y二2.2063X+0.1028)算出所定容樣品溶液的硫酸根濃度(X)為0.8221mg/ml，根據所定容樣品溶液體積lml和所用多糖硫酸酯千物質樣品的質量2mg算出該乾物質樣品的硫酸根含量為41.11%，最後由硫在硫酸根中的質量百分比(33.33%)算出該乾物質樣品的硫含量13.70%。實施例3本發明一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法，包括如下步驟(1)繪製標準曲線並建立回歸方程稱取14.80gNa2S04定容於100ml容量瓶中製備硫酸根(S042—)濃度為100mg/ml的母液，然後，依次稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的硫酸根梯度標準溶液。取此梯度標準溶液分別注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，以峰面積平均值為縱坐標(Y)、硫酸根梯度標準溶液濃度為橫坐標(X)繪製標準曲線(圖3)並建立回歸方程Y=2.2153X+0.0949，R2=0.9991;(2)樣品的處理準確稱取2mg待測多糖硫酸酯乾物質樣品，加入濃度為4mol/L鹽酸3ml，在10(TC下氮氣保護水解5小時，然後在5(TC，0.07MPa下減壓濃縮蒸餾得到乾物質A;(3)樣品硫含量的測定將乾物質A用超純水溶解定容至lml，取所定容的樣品溶液注入高效液相色譜檢測(液相色譜圖如圖4)，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，將峰面積平均值2.4876代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y二2.2153X+0.0949)算出定容後樣品溶液的硫酸根濃度1.0801mg/ml，再根據所定容樣品溶液體積lml和所用多糖硫酸酯乾物質樣品的質量2mg算出該乾物質樣的硫酸根含量54.01%，最後由硫在硫酸根中的質量百分比(33.33%)算出該乾物質樣品的硫含量17.80%。權利要求1、一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)繪製標準曲線並建立回歸方程取一定質量的Na2SO4定容於容量瓶中製備硫酸根濃度為100mg/ml的母液，然後，依次稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的硫酸根梯度標準溶液。取此梯度標準溶液分別注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，以峰面積平均值為縱坐標、硫酸根梯度標準溶液濃度為橫坐標繪製標準曲線並建立回歸方程；(2)樣品的處理稱取待測多糖硫酸酯乾物質樣品，加入濃度為1～4mol/L的鹽酸，其中所述乾物質樣品與鹽酸的比例為，重量∶體積＝1mg∶1～2ml，在100℃下氮氣保護水解4～6小時，然後在40～60℃、0.06～0.08MPa下減壓濃縮蒸乾得到乾物質A；(3)樣品硫含量的測定將乾物質A用超純水溶解定容，使其硫酸根濃度在0.05～10mg/ml範圍內，取所定容的樣品溶液注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品測定三次，將峰面積平均值代入步驟(1)中所建立的回歸方程算出定容後樣品溶液的硫酸根濃度，根據所定容樣品溶液中硫酸根的質量和所用多糖硫酸酯乾物質樣品的質量算出該乾物質樣品的硫酸根含量，最後由硫在硫酸根中的質量百分比(33.33％)算出該乾物質樣品的硫含量。全文摘要本發明公開了一種快速測定多糖硫酸酯中硫含量的方法。本發明用高效液相色譜檢測處理後的樣品溶液，通過配製梯度標準溶液、製作標準曲線並建立回歸方程以計算所測多糖樣品中的硫含量。本發明方法中所測多糖溶液與流動相混合液的相溶性很好、標準曲線線性範圍較寬，克服了以往測定硫含量過程中操作繁瑣，雜質幹擾嚴重，精確性、靈敏度不理想，線性範圍較窄等缺點；本發明方法檢測結果準確可靠，簡化檢測步驟而節省了測定時間，測定費用低，易於推廣實施。文檔編號G01N30/02GK101620210SQ200910161388公開日2010年1月6日申請日期2009年8月12日優先權日2009年8月12日發明者健姚,繼張,桑春豔,梁俊玉,王雲普,王俊龍,王小芳,趙保堂,趙美榮,馬君義申請人:西北師範大學