與整合素αvβ3受體具有高親和力的多肽的製作方法
2023-07-20 08:34:36 1
專利名稱：與整合素αvβ3受體具有高親和力的多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程製藥、蛋白質多肽類藥物及生物醫學工程領域，涉及對整合素受體a 3具有高親和力的多肽及其應用,例如用於癌症診斷和治療中。
背景技術：
整合素家族是一個由許多結構和功能相似的蛋白質所組成的膜受體家族，每個成員的分子都是由a、3兩條鏈(亞基)通過非共價鍵連接形成的跨膜異二聚體糖蛋白，是細胞表面重要的兼具黏附和信號傳導功能的受體。現已經發現了由18種a亞基和8種^亞基構成的24種整合素，a和3亞基共同決定整合素的受體特異性。整合素通過胞外域與細胞外基質(extracellularmatix, ECM),胞內段與細胞骨架、信號轉導分子和其他一些蛋白相結合，介導細胞內外之間的雙向信號傳遞。一方面，細胞內信號通過整合素傳導，使其活化，從而調節整合素與細胞外配體的親和力；另一方面，整合素與配體結合後把胞外信號傳入細胞內，導致細胞骨架重組、基因表達和細胞分化等。整合素在細胞的黏附、增殖、分化、轉移、凋亡等過程中起著重要的調控作用，在腫瘤的侵襲轉移中發揮著重要作用，a 3就是其中的一種重要分子。研究表明，整合素a 3在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤等多種實體腫瘤細胞表面有高水平的表達。迄今，一系列的整合素a vP 3的拮抗劑和分子探針相繼被發現，L M 609(商品名Avasti n，貝伐單抗，基因泰克公司)LM 609是鼠抗人整合素a v P 3單克隆抗體，它能與起源於兔、雞和倉鼠的a V ￠3發生特異性反應。與其他的單克隆抗體如a V或@ 3相比，L M 609具有特異性和高效性的特點。L M 609潛在的局限性在於它只能阻止a V ￠3介導的血管生成，而對其他整合素受體介導的血管生成途徑沒有影響。CNTO 95 CNT O 95是一個完全人性化的抗體且能夠識別多個a v整合素，在一期臨床試驗中，C N T O 95表現出了良好的安全性和耐受性。17 E 6抗體17 E 6抗體是對純化的人a V 3 3提出，能與至 少a V 33、a v ￠5和a v 3 I發揮作用。17 E 6抗體通過a V強烈幹擾細胞黏附，並抑制整合素與配體的結合。Bosc h等研究發現，17 E 6能夠抑制H I V -1感染原發性巨噬細胞，且對H I V -1急性感染的巨噬細胞的B A L複製的影響呈劑量依賴性，表明a V亞基可能是愛滋病毒感染的藥理學靶點。除了以上報導的之外，還有許多其他類型的拮抗劑，如去整合素、多肽(主要是基於R G D序列)和非肽類分子，也能特異性結合整合素a V ￠3而發揮作用。基於基質蛋白中RGD三肽序列能與整合素a 3特異結合，研究者們合成了大量含RGD序列的線形或環形多肽作為整合素a 3的拮抗劑。對a V 0 3拮抗多肽的構效關係研究發現，含有2個二硫鍵的環形RGD多肽對腫瘤新生血管內皮細胞的抑制效力最強，是含單一二硫鍵環形RGD多肽的20倍，。環形RGD多肽由於多價態可以同時和幾個a V 0 3結合，因此較線形RGD多肽有更高的受體結合特異性。吳國球發現了三條與整合素a 3具有高親和力的序列長度為17個胺基酸和18個胺基酸的多肽。此外，通過形成均多聚體或雜多聚體也可提高RGD肽對整合素受體的結合率和選擇性。對RGD肽進行人為修飾的另一個發展方向是使RGD肽多聚化。多聚化RGD環肽具有比單體更高的親和力，可有效提高腫瘤對放射性藥物的攝取，延長放射性藥物在腫瘤中的滯留時間。研究表明，只要RGD肽多聚體的連接體有足夠的長度，RGD肽多聚體的每個單體都可以與整合素受體結合，且結合力比RGD單體的結合力要高很多，目前多聚化RGD肽已經由最初的二聚體逐漸發展到四聚體、八聚體，並向超聚體的方向發展。Li等用64Cu標記環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絡氨酸-賴氨酸[c (RGDyK)]的四聚體和八聚體，並進行體外實驗和小動物正電子發射計算機斷層顯像(PET)顯像，體外實驗顯示八聚體的特異性和親和力都高於四聚體，八聚體的半數抑制濃度(IC50)值為10nM，四聚體的IC50值為35nM，動物顯像也更為清晰，且在腫瘤部位存留時間長。
發明內容
本發明公開了我們發現的兩條對整合素a 3具有高親和力的多肽，且這兩條非RGD的多肽比傳統的RGD肽對於整合素a vP 3具有更強的親和力。採用花菁類近紅外螢光染料(ICG-Der-02)，其側鏈上有一個羧基官能團，適用作生物螢光標記。通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀醯亞胺(EDC/NHS)催化體系可以有效地將將其活化，與多肽分子鏈末端的氨基共價偶聯形成醯胺鍵，構建花菁類近紅外螢光染料-肽(ICG-Der-02-peptide)分子探針，從而可使多肽帶有明顯的近紅外螢光特性。這些多肽對整合素a 3受體特異結合的性質實現特定惡性腫瘤的近紅外成像，從而達到實時無損在位監測早期惡性腫瘤的目的。整合素a 3受體在乳腺癌、肺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等多種實體腫瘤細胞表面有高水平表達，下面的試驗選用了乳腺癌細胞(MDA-MD-231)與多肽連接有較好的靶向，給藥後腫瘤部位即有明顯的信號。這些多肽序列偶聯的探針是一種水溶性良好，毒性較低，靶向作用良好的腫瘤診斷試劑，它們的發現為進一步腫瘤藥物的研發拓展了新的空間，對於合理設計腫瘤治療方案提供了重要的基礎。本發明公開 了兩條對整合素a vP 3有高親和力的多肽，可用於腫瘤的治療與診斷。其胺基酸序列為I > Arg-Trp-Arg (以下簡稱 RWR);2> Arg-Lys-Tyr (以下簡稱 RKY);這2條多肽對整合素a 3具有高親和力，單獨或組合用於在腫瘤新生血管的治療或診斷、用於藥物輔料或連接物的應用。本發明兩條新的對整合素a 3具有高親和力的多肽，擴大了與CIV0 3受體結合肽的種類。現有針對整合素a #3的診斷試劑，它們一般含有傳統經典的RGD序列，而本發明的對整合素a # 3具有診斷試效果的這些多肽均為非RGD的序列，且均為小肽，合成成本低廉。本實驗採用一種近紅外螢光染料ICG-Der-02 (吲哚花箐類衍生物)，結構式如下
權利要求
1.一種與整合素^^0 3具有高親和力的多肽，其序列為4找-1'印4找。
2.—種與整合素[^0 3具有高親和力的多肽，其序列為4找-1^8-171'。
3.權利要求1或2的多肽用於製備治療癌症的藥物的用途。
4.權利要求1或2的多肽用於製備診斷癌症的試劑的用途。
全文摘要
本發明屬於生物工程製藥、蛋白質多肽類藥物及生物醫學工程領域，涉及對整合素受體αvβ3具有高親和力的多肽及其應用，多肽序列為Arg-Trp-Arg或Arg-Lys-Tyr。本發明的多肽比傳統的RGD肽對於整合素αvβ3具有更強的親和力。可用於癌症診斷和治療中。
文檔編號A61P35/00GK103044522SQ201310019870
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者顧月清, 艾觀華, 董雪, 牛淼淼 申請人:中國藥科大學