一種β-氨基己糖苷酶A酶活性檢測方法、底物和試劑的製作方法

2023-07-20 01:00:46 2

一種β-氨基己糖苷酶A酶活性檢測方法、底物和試劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種β-氨基己糖苷酶A（EC3.2.1.52）酶活力檢測的方法，同時本發明還提供了測定β-氨基己糖苷酶A酶活性的底物和試劑，上述方法、底物和試劑可用於分析測定待測樣本（包括人體體液或組織或細胞樣本）中的β-氨基己糖苷酶A活力，主要應用於臨床檢驗領域。採用本方法製備的測定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點，便於推廣應用。
【專利說明】一種β -氨基己糖苷酶A酶活性檢測方法、底物和試劑
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥【技術領域】，同時又屬於遺傳代謝病的臨床診斷檢測領域。具體而言本發明提供了一種測定氨基己糖苷酶A ( β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的方法，同時本發明還提供了一種作為β-氨基己糖苷酶A ( β -HexosaminidaseA, EC 3.2.1.52)的酶活性檢測的底物，此外本發明還提供了測定β-氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活性的試劑。
【背景技術】
[0002]溶酶體是人體細胞內一種由單位膜包裹的細胞器，內部含有多種酸性水解酶，目前已發現的有60多種，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶類。在細胞內溶酶體酶控制著多種內源性和外源性大分子物質的消化，如核酸、蛋白質、脂質、多糖及糖原等，因此，溶酶體又被稱為細胞內的消化器官。人體每天的新陳代謝會產生許多人體不需要的大分子物質，如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等，這些大分子物質需經過溶酶體酶處理後水解成小分子物質方能繼續參與機體代謝或排出體外。如果溶酶體內某種水解酶的活性降低或缺失將會導致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積，從而使得溶酶體發生腫脹，細胞變得臃腫失常，細胞功能受到嚴重影響，最終導致一系列疾病，這類疾病統稱為溶酶體忙積症(Lysosomal Storage Diseases,簡稱LSDs)。依忙積的大分子物質種類差異將溶酶體貯積症分成以下幾種主要類型:黏多糖貯積症、糖原累積病II型、黏脂質貯積病、神經鞘脂貯積病、糖蛋白貯積症等。
[0003]據歐美國家初步統計資料表明，溶酶體貯積症作為一個整體，在新生兒中患病率可聞達1/8，000~1/5，OOO0目如在中國尚未進彳丁篩查統計，但隨著生化檢測技術的提聞，國內溶酶體貯積症的檢出率明顯提高，且呈逐步上升趨勢。
[0004]Tay-Sachs病是一`種常染色體隱性遺傳性疾病，又稱為B型GM2神經節苷脂沉積病，屬於神經鞘脂貯積病的一種，是由於己糖胺酶a鏈缺陷、GM2在神經元累積所導致，導致GM2神經節苷脂分解代謝異常，而在體內(腦、眼、肝、脾和骨髓)中累積，影響細胞功能。
[0005]根據起病年齡和臨床表現可分為嬰兒型、晚發嬰兒型和晚發(兒童、青春期、成人)型二種。
[0006]本病可見於世界上任何種族，但發病率不同。西亞和東歐的猶太人發病率最高，幾乎比其他民族高100倍。國內尚無Tay-Sachs病的流行病學資料，但隨著生化檢測技術的提高，Tay-Sachs病的檢出率明顯提高。
[0007]Tay-Sachs病確診困難表現在多方面:首先因該病是多系統疾病，涉及遺傳、神經、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系統，症狀表現複雜，並且與多種常見疾病有相似的臨床表現，因此醫生很難從症狀表現上積累診斷經驗，因此漏診、誤診及延誤診斷的發生是普遍存在的問題。其次醫院現有的各項常規檢查等輔助手段均難以達到確診的目的，如骨髓穿刺、體格檢查、心電圖、腦電圖、B超、CT/核磁、X線、肌肉活檢、血清肌酸磷酸激酶檢查等諸多檢查方法均無法對Tay-Sachs病的真正致病因素加以分析，因此不能對患者疾病作出準確診斷。基因檢測困難重重，因單核苷酸序列多態性的存在，可能某些突變就是正常的，不會引發疾病，因此給分析帶來不確定性；另外由於酶的活性還與其他一些參與酶功能的基因有關，有很多這類基因目前還未被研究人員發現，因此基因檢測同樣不能作為診斷的可靠依據。
[0008]導致Tay-Sachs病產生的直接因素就是患者體內單一 β -氨基己糖苷酶A酶活性降低或完全缺失，而且病情嚴重程度往往與酶活性殘留的比例密切相關，因此判斷患者β -氨基己糖苷酶A的活性是否正常，同時結合患者的臨床症狀表現，就可以快速準確地對病人的疾病作出診斷。因此β_氨基己糖苷酶A酶活性檢測作為Tay-Sachs病的診斷依據具有其他方法不能比擬的優勢，臨床上通過對疑似Tay-Sachs病患者進行β -氨基己糖苷酶A活性檢測，可以實現早診斷、早治療，對Tay-Sachs病預後，減少疾病給家庭及社會帶來的影響及隱患具有重要意義。國內外臨床實踐證明檢測β_氨基己糖苷酶A活性是輔助確診該病的最佳手段。本發明就是基於這些技術背景和社會現實需求，根據β_氨基己糖苷酶A的酶催化活性的特點，設計合成含有螢光基團的β_氨基己糖衍生物作為酶催化反應的底物，從而可以快速靈敏的測定待測樣本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。待測樣本中的氨基己糖苷酶A可以將含螢光基團的β-氨基己糖硫酸鹽水解後釋放出螢光分子和β-氨基己糖硫酸鹽，其水解底物的速率與釋放螢光分子的螢光強度成正比，這樣就可以計算待測樣本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。採用本方法製備的測定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點，便於推廣應用。

【發明內容】

[0009]本發明要解決的技術問題是:提供一種快速、準確可靠的氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的螢光檢測法，同時本發明還提供用於螢光法測定β -氨基己糖苷酶A活性的檢測試劑，採用該方法和試劑可以在半自動或全自動的螢光光度計或酶標儀等螢光檢測設備上使用，而且檢測靈敏度高，特異性高，操作簡便，因而可以得到切實的推廣使用。
[0010]為解決技術問題 ，本發明提供的技術方案如下:
本發明的β-氨基己糖苷酶A酶活性測定方法原理如下:
R-β-氨基己糖硫酸鹽+ H2O 3-観己糖苷酶aR-OH + β-氨基己糖硫酸鹽。
[0011]具體為:β -氨基己糖苷酶A在特定條件下能夠水解合成的本身無螢光的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，釋放游離的螢光分子R-0H，在特定的激發和發射波長下可檢測到R-OH特異的螢光，由於β -氨基己糖苷酶A水解底物的速率與釋放螢光分子的螢光強度成正比，因此檢測在特定激發波長和發射波長下的R-OH螢光值，就可以計算出β -氨基己糖苷酶A的酶活力。
[0012]β -氨基己糖硫酸鹽(β-Hexosamine sulphate salt)通用的結構式為:
【權利要求】
1.一種β-氨基己糖苷酶A酶活性測定方法，其特徵在於它的原理如下: R- β -氨基己糖硫酸鹽+ H20g-氨基己糖苷酶A.R-OH + β -氨基己糖硫酸鹽。
2.具體為氨基己糖苷酶A在特定條件下能夠水解合成的本身無螢光的底物R- β -氨基己糖硫酸鹽，釋放游離的螢光分子R-0H，在特定的激發和發射波長下可檢測到R-OH特異的螢光，由於β -氨基己糖苷酶A水解底物的速率與釋放螢光分子的螢光強度成正比，因此檢測在特定激發波長和發射波長下的R-OH螢光值，就可以計算出β -氨基己糖苷酶A的酶活力。
3.如權利要求書I所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特徵在於它的通用結構式為:
4.當β-氨基己糖苷酶A在特定條件下特異的水解R-β-氨基己糖硫酸鹽時又可以釋放出遊離的具備螢光特徵的R-OH分子。
5.如權利要求書I和2所述的底物R-β -氨基己糖硫酸鹽以及合成該底物的具備螢光特徵的R-0H，其特徵在於R-OH是在物理和化學領域普遍被接受的任何具備螢光特徵且能與-CHO進行反應的分子。
6.如權利要求書1-3所述的底物R-β -氨基己糖硫酸鹽，其特徵在於螢光分子R-OH是與β -氨基己糖硫酸鹽上的I位C上的醛基(-CHO)連接而形成R-β -氨基己糖硫酸鹽。
7.如權利要求書1-4所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特徵在於硫酸基團是處在β -氨基己糖硫酸鹽的3，4，6位C的任一位點上。
8.如權利要求書1-5所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特徵在於氨基乙醯基團是處在β -氨基己糖硫酸鹽的的2位C上形成R- β -氨基己糖硫酸鹽。
9.一種氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於其主要成分包括: 緩衝液20— 1000mmol/L pH 範圍2 — 8.5 穩定劑0.01% —10%
如權利要求書1-6所述的底物(R-β -氨基己糖硫酸鹽)0.01一10mmol/L 根據權利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於:由緩衝液、穩定劑、R- β -氨基己糖硫酸鹽組成單劑試劑。
10.根據權利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於:由緩衝液、穩定劑、R-β -氨基己糖硫酸鹽組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑組成；試劑2，由緩衝液、R- β -氨基己糖硫酸鹽組成。
11.根據權利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於:由緩衝液、穩定劑、R-β-氨基己糖硫酸鹽組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑組成；試劑2，由R- β -氨基己糖硫酸鹽組成。
12.根據權利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於:所述的穩定劑主要包括被物理和化學上普遍接受和使用的各種表面活性劑。
13.如權利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測試劑，其特徵在於:所述的緩衝液中的緩衝試劑是被物理和化學上普遍接受的能將體系的PH值緩衝或穩定在2—8.5的範圍中的試劑。
14.如權利要求書1-12所述的β-氨基己糖苷酶A活性檢測方法或試劑，其特徵在於，它可以用於檢測待測樣本中的β_氨基己糖苷酶A的酶活力，特別是檢測人體體液或組織或細胞樣本中氨基己糖苷酶A的酶活力，應用到臨床檢測或診斷與β-氨基己糖苷酶A的酶活力相關的疾病。
【文檔編號】C12Q1/34GK103484526SQ201210195944
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月14日 優先權日:2012年6月14日
【發明者】孫宏博 申請人:北京和信非凡生物技術有限公司