一種用單條染色體構建文庫方法

2023-08-10 05:15:56

一種用單條染色體構建文庫方法
【專利摘要】本發明提供一種用單條染色體構建文庫方法，本發明採用分輪擴增的辦法，消除了PCR隨機偏向性問題；內切酶可選餘地大，靈活，粘性末端連接效率高；使用人為設計的接頭作特異引物，可用較高的退火溫度，消除了非特異性擴增問題，採用超聲隨機打斷後，通過加A反映，然後加接頭的做法，屬於本發明的擴展，與高通量測序技術相結合進行物種的基因組從頭測序，將消除基因組測序中多染色體高雜合度不能正確組裝和染色間組裝錯誤問題，為基因組測序開闢廣闊的前景。
【專利說明】一種用單條染色體構建文庫方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用單條染色體構建基因組文庫的方法，尤其涉及一種用單條染色 體構建文庫方法。

【背景技術】
[0002] 基因組序列信息是了解物種遺傳信息的最基本、最全面、最重要的途徑。隨著新一 代測序技術或稱為高通量測序技術的出現，不少物種的全基因組測序已經完成，為這些物 種基因資源的開發利用提供了便利，也為其他物種的基因組測序提供了有益的參照。如今， 高通量測序技術成本不斷下降，越來越多的物種可望用高通量測序技術實現全基因組從頭 測序。然而，由於目前常用的高通量測序技術的讀長短，基因組的正確組裝仍是巨大的挑 戰，尤其是雜合度高的植物只能得到基因組框架圖而非精細圖。解決基因組測序雜合度問 題的最佳途徑是單染色體測序。如果能解決單染色體建庫的技術問題，那麼任何物種的全 基因組測序就有了希望。因此，本發明以已經分離出的牡丹第5號染色體為例，探索用單條 染色體構建全染色體文庫的技術途徑，為單染色體測序提供技術準備。
[0003] 本發明採用內切酶消化後引入接頭而後通過基因組無偏PCR擴增的建庫方法。首 先用識別四個鹼基的II型限制性內切酶對單條染色體進行消化，使其成為帶有粘性末端 的小片段，用連接酶向片段的兩端加上預先設計好的接頭，然後利用接頭做引物進行多輪 PCR擴增，實現單染色體片段的倍增，從而達到高通量測序的要求。


【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題在於，針對現有技術的不足，而提供一種用單條染色體 構建文庫方法。
[0005] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：提供一種用單條染色體構建文庫方 法，酶切時採用了來自NEW England Biolabs的Acil限制性內切酶；HinPll限制性內切酶； HpyOMIV限制性內切酶；Mspl限制性內切酶，濃度均為lOunit/μ L。這四種酶為同尾酶， 即識別序列不同，但是所切出的粘性末端相同。使用同尾酶的好處是可以設計通用的接頭 和引物，即方便又經濟。為了使內切酶消化後的DNA片段適合高通量測序的讀長，本發明採 用雙酶切體系。
[0006] 在連接實驗中，選用了 T4DNA連接酶，這種酶在16-20°c的條件下活性較大，連接 效率較好。
[0007] 在PCR過程中，採用了保真性較好KOD-plus，濃度為limit/μ L，這種聚合酶產自 Toyobo,其保真性是普通聚合酶的幾百倍。
[0008] 在接頭的選擇上以廣泛使用的Sau3Al接頭為基礎，進行了適當的改良，使其與粘 性末端匹配更好。接頭的序列如下：
[0009] 正向接頭 5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3'
[0010] 反向接頭 5，-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3，
[0011] 正向接頭的相對分子質量5868. 8,每OD的質量為27. 9微克，長度為19個鹼基， 每OD的摩爾數為4. 7nmol。反向接頭的相對分子質量6367. 3, OD的質量為28. 5微克，長 度為21個鹼基，每OD的摩爾數為4. 7nmol。雙連結頭的相對分子質量為12236. 1，在製作 接頭時加入等摩爾數的正反向寡核苷酸片段，先在94°C的條件下充分變性，然後再自然降 溫至室溫，降低錯配的可能性。
[0012] 本發明的實驗步驟如下。
[0013] ⑴雙內切酶消化
[0014] 酶切的體系如下：
[0015]

【權利要求】
1. 一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：包括以下步驟： (1) 對單染色體中的蛋白酶K滅活，加入酶切體系，酶切。 (2) 加入等量的正反向單連結頭，製作通用接頭。加入適量的接頭到酶切產物中，使接 頭與酶切片段連接。 (3) 向連接產物中加入PCR擴增體系，利用小循環多次擴增的方式進行擴增，期間對每 輪的產物合管混合後再分管以降低PCR偏好。
2. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（1) 中，蛋白酶K的滅活條件為95°C 10_20min。
3. 根據權利要求2所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（1) 中，採用的限制性內切酶為同尾酶，方便接頭的設計。
4. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（1) 中，利用T4DNA連接酶緩衝液替換原限制性內切酶的緩衝液。
5. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（1) 中，酶切的體系為 限制性內切酶1 ιμ?_ 限制性內切酶2 1ML T4DNA連接酶緩衝液 3 μ L 染色體DNA 1ML 無菌水 4 ML 。
6. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（1) 中，酶切的條件為37°C 3小時處理，並65°C lOmin滅活限制性內切酶。
7. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（2) 中，接頭的序列為 正向接頭 5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3' 反向接頭 5' -CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3'。
8. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（2) 中，接頭的製作條件為94°C 5-10min，52°C 20-30min處理之後在室溫下放置2-3h。
9. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟（2) 中，連接的體系為 酶切體系 1〇μ L DNA接頭 2μ L T4DNA連接酶 1μ L T4DNA連接酶緩衝液 2μ L 。
10. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟 ⑵中，連接的條件為16-20°c恆溫連接10小時。
11. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步驟 (3)中，採用小循環多次擴增的方式進行擴增，產物合管混合後再分管以降低PCR偏向。
12. 根據權利要求1所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於：所述步 驟⑶中，PCR 擴增的程序為 94°C 3min，lcycle ;94°C 30S，52°C 40S，72°C 50S，10cycle ; 72°C 10min4°C 00,lcycle〇
13. 根據權利要求1-12中任一所述的一種用單條染色體構建文庫方法，其特徵在於： 所述實驗材料為單條染色體。
【文檔編號】C40B50/06GK104294370SQ201410474304
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】劉豔磊 申請人:北京眾科生物科技服務有限公司